Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung von Neuronen des parasympathischen Ganglion sphenopalatinum der transgenen Mauslinie MOL2.3-IGITL
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Zusammenfassung
Olfaktorische Rezeptorproteine (OR) gehören zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, wobei einige der transmembranalen OR nicht nur in chemosensorischen, primären Sinneszellen des olfaktorischen Epithels, sondern auch in anderen Geweben nachweisbar sind. So ermöglichte die Co-Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) mit dem kürzlich identifizierten OR MOL2.3, einem orphan Rezeptor mit unbekanntem endogenen bzw. exogenen Liganden, in der transgenen Mauslinie MOL2.3-IGITL die molekularbiologische und fluoreszenz-mikroskopische Lokalisation des MOL2.3-Genprodukts zunächst in spezifischen, olfaktorisch sensorischen Neuronen der murinen Riechschleimhaut. GFP-positive Zellen konnten zusätzlich in distinkten Arealen des Hirnstammes (Area postrema, Nucleus tractus solitarii) sowie in umschriebenen Zellpopulationen cranialer und thorakaler Ganglien des Sympathikus (Ganglion cervicale craniale, Ganglia cervico-thoracica) bzw. Parasympathikus (Ganglion sphenopalatinum) demonstriert werden. Zielgewebe, welche efferent von Neuronen des parasympathischen Ganglion sphenopalatinum (SPG), inklusive zahlreichen, das MOL2.3-Gen exprimierenden Zellen, innerviert werden, sind die lateralen Nasendrüsen, die Harder´schen Drüsen sowie bestimmte Segmente cranialer Blutgefäße.Die Transkription eines OR-Gens wie MOL2.3 in ganglionären Einheiten des autonomen Nervensystems wirft nun die Frage nach (1) der möglichen Funktion dieses orphan Rezeptors in den exprimierenden Zellen, bzw. (2) möglicherweise unterschiedlichen funktionellen Charakteristika MOL2.3-positiver versus MOL2.3-negativer Ganglienzellen der Maus auf. In der vorliegenden Arbeit konnte zunächst demonstriert werden, dass der MOL2.3-Rezeptor - identifiziert über den co-exprimierten histologischen Marker GFP - in etwa 50 Prozent aller SPG-Neurone der MOL2.3-IGITL Maus exprimiert wird. Der gleichzeitige, fluorometrische Nachweis zweier Antigene ermöglichte die detaillierte, immunhistochemische Analyse der murinen, SPG-intrinsischen und GFP-positiven Neurone und die Erarbeitung ihres zellspezifischen 'Neurotransmitter-Coding'. So ergab sich eine signifikante Co-Lokalisation des orphan Rezeptors mit den cholinergen Markerproteinen Cholin-Acetyl Transferase (ChAT, >90 %) und vesikulärer Acetylcholin Transporter (VAChT, 90 %), sowie der neuronalen Stickstoffmonoxid Synthase (nNOS, 75 %) als generierendem Enzym des volatilen Botenstoffs Stickstoffmonoxid (NO). Zahlreiche dieser als nitrerg, cholinerg oder cholinerg/nitrerg klassifizierbaren MOL2.3-positiven Neurone erwiesen sich darüber hinaus als cholinerg innerviert, sei es auf klassisch efferente oder retrograd auto- bzw. pararegulatorische Art und Weise. Einige GFP-positive Neurone des SPG neonataler Mäuse co-exprimierten die peptidergen Neuromodulatoren Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) bzw. Substanz P (SP). In funktionellen, zellphysiologischen Versuchsansätzen - durchgeführt an Kurzzeit-kultivierten Ganglienzellen des murinen SPG - sollte mittels mikrospektrofluorometrischer Ratio-Imaging Technik (Fura-2) die Bedeutung der immuncytochemisch nachgewiesenen endogenen Neurotransmitter/-modulatoren für die intrazelluläre Signaltransduktion vergleichend in MOL2.3-positiven und -negativen Neuronen ermittelt, und die Daten miteinander verglichen werden. In vitro Untersuchungen an MOL2.3-positiven wie -negativen Zellen konnten für beide Zelltypen eine dosisabhängige, wiederholbare und nicht desensibilisierbare Stimulierbarkeit mit Acetylcholin nachweisen, wobei der Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration ([Ca2+]iz) auf dem Einstrom extrazellulären Calciums in die Zelle beruhte. Mit Subtyp-spezifischen, cholinergen Rezeptoragonisten konnten die Acetylcholinrezeptoren (AChR) als überwiegend nicotinerg definiert werden, wobei einzelne Zellen zusätzlich muscarinerge AChR exprimierten. Die nicotinergen AChR der MOL2.3-positiven und -negativen Zellen ließen sich als homomere α7 Rezeptoren klassifizieren, diejenigen der MOL2.3-negativen Zellen zusätzlich als heteromere α3β4 Proteine. Nach cholinerger Stimulation der Zellen strömte extrazelluläres Calcium zum einen durch die genannten nAChR Subtypen ins Zytoplasma, zum Teil auch durch sekundär geöffnete, spannungsabhängige Calciumkanäle des L-Typs, wie mit Co-Stimulationen durch selektive Calciumkanal-Blocker demonstriert werden konnte. Die repetitive Superfusion der Zellpräparationen mit Acetylcholin bei Ausschluss einer Desensibilisierung der Zellen ermöglichte weiterhin eine detaillierte Charakterisierung der cholinergen Signaltransduktion MOL2.3-positiver und negativer Zellen im Hinblick auf eine etwaige modulatorische Rolle von NO oder PACAP. Stimulation mit den potenten NO-Donoren DEA und Nor-1 per se aktivierten ebenso eine intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, bestimmt durch den Anstieg der [Ca2+]iz. Co-Stimulationen der Zellen mit Acetylcholin und DEA zeigten darüber hinaus, dass freigesetztes NO einen transient hemmenden Einfluß auf die cholinerge Aktivierung der MOL2.3-positiven Zellen, nicht aber der MOL2.3 negativen Zellen bewirkte. Diese Beobachtung könnte mit der Expression des MOL2.3-Rezeptors in direktem Zusammenhang stehen. Olfaktorische Rezeptoren können, wie auch NO selbst, cGMP-vermittelt unspezifische Kationenkanäle aktivieren, woraufhin sekundär die Aktivität des nAChR vermindert wird. Etwa die Hälfte der ganglionären Zellen erwies sich als responsiv für das Neuropeptid PACAP, welches im Unterschied zu NO - zudem eine Hemmung der Zellantwort auf Acetylcholin in beiden, nicht nur den MOL2.3-positiven Neuronentypen induzierte. Diese Hemmung dürfte auf einer Desensibilisierung der α7 nAChR durch PACAP beruhen. Das Neuropeptid PACAP könnte im Rahmen der Zell-spezifischen Funktionen des SPG z.B. die Sensitivität nicotinerger AChR, die Freisetzung von Acetylcholin, oder mittels Aktivierung von Calciumkanälen des L-Typs die NO-Synthese modulieren. Die ganglionären Neuronen zeigten sich als nicht-responsiv für Noradrenalin und Glutamat. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass zwischen den hier charakterisierten Transmittersystemen des Ganglion sphenopalatinum der neonatalen Maus komplexe hemmende wie auch aktivierende Interaktionen möglich sind. Der MOL2.3-Rezeptor könnte demzufolge im Ganglion sphenopalatinum eine essentielle Rolle bei adaptiven neuronalen Prozessen spielen und die Zellen so vor Stimulation mit zu starken Stimuli schützen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2004