Untersuchung zur funktionellen Bedeutung von VDAC in weiblichen Gameten des Rindes und des Marmoset-Affen
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Zusammenfassung
Voltage-dependent anion channels (VDACs) besitzen eine Molekularmasse von 30-36 kDa und kommen in der äußeren mitochondrialen Membran, in der Plasmamembran von Eukaryoten und in der Bakterienzellmembran vor. Bisher sind drei VDAC-Subtypen bekannt, VDAC1, VDAC2 und VDAC3. Mittels elektrophysiologischer Untersuchungen mit rekombinantem VDAC1-und 2-Protein wurden den Ionenflux regulierende, porenbildende Eigenschaften nachgewiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Vorkommen und die mögliche physiologische Bedeutung der drei VDAC-Subtypen VDAC1, VDAC2 und VDAC3, im bovinen und im Marmoset-Ovar untersucht. Mit Hilfe der RT-PCR konnte die Expression VDAC-kodierender Gene in bovinen Oozyten für VDAC1, 2, und 3 und erstmals in Callithrix jacchus-Oozyten für VDAC1 und 3 gezeigt werden. Die Ergebnisse wurden jeweils durch Sequenzierung der Amplifikate bestätigt. Ebenfalls konnte VDAC-Protein mit Hilfe von subtypspezifischen anti-VDAC-Antikörpern (anti-VDAC1, -2 und -3) immunhistochemisch im bovinen und zum ersten Mal im Marmoset-Ovar nachgewiesen werden. In den untersuchten Ovarien zeigten sich sowohl speziesspezifische als auch vom Follikelstadium abhängige Unterschiede in der Lokalisation und in der Intensität der Immunreaktion der nachgewiesenen VDAC-Proteine. VDAC1- und VDAC3-Protein wurde in bovinen Oozyten und Follikelzellen aller Follikelstadien (Primordial- bis Tertiärfollikel) gefunden. VDAC2 konnte im bovinen Ovar hingegen nicht detektiert werden. Im Marmoset-Ovar wurde VDAC1 in Oozyten und Follikelzellen aller Follikelstadien (Primordial- bis Tertiärfollikel) nachgewiesen, während VDAC2 ausschließlich in Oozyten von Primär-, Sekundär- und Tertiärfollikeln vorkam. VDAC3-Protein konnte mit dem subtypspezifischen anti-VDAC3-Antikörper AS P31 nicht visualisiert werden. Ergänzend zu den immunhistochemischen Experimenten bestätigten immunzytochemische Untersuchungen mittels indirekter Immunfloureszenz und konfokaler Lasermikroskopie das Vorhandensein von VDAC1- und VDAC3-Protein in bovinen Oozyten. VDAC1 konnte mit dieser Methode sowohl in der Plasmamembran als auch intrazytoplasmatisch, VDAC3 ausschließlich intrazytoplasmatisch lokalisiert werden. Zur Überprüfung der funktionellen Relevanz der durch die Antikörper detektierten VDAC- Epitope wurden Untersuchungen zur Volumenregulation, speziell zum Regulatory Volume Decrease (RVD), nach hypotoner Stimulation an bovinen Oozyten durchgeführt. Die Oozyten wurden vor der digitalphotographischen Volumenmessung entweder in einem subtypspezifischen anti-VDAC-Antikörperserum präinkubiert, oder die Antiseren wurden direkt in die Oozyten injiziert. Ein statistisch signifikanter inhibierender Effekt auf das RVD konnte sowohl nach der Injektion des anti-VDAC2-Antiserums AS P45 als auch nach der Injektion bzw. Inkubation des anti-VDAC3-Antiserum AS P31 beobachtet werden. Weder die Inkubation noch die Injektion von anti-VDAC1-Antiserum AS P6 oder die Inkubation mit AS P45 führten zu einer negativen Beeinflussung des RVD. Die erzielten Ergebnisse der Arbeit und Daten aus der Literatur weisen darauf hin, dass eine Interaktion von VDAC mit Komponenten des Zytoskeletts verantwortlich für das RVD sein könnte. Weitere Studien sind notwendig, um diese Hypothese zu unterstützen. Die im Rahmen der Dissertation erzielten Ergebnisse zur Synthese, Lokalisation und Funktion von VDAC-Isoformen im Ovar von Rind und Marmoset (Callithrix jacchus) können Ausgangspunkt für weitere wissenschaftliche (z.B. funktionelle Bedeutung von VDAC-Proteinen in der Physiologie der Fortpflanzung von Säugetieren) und klinische Fragestellungen (z. B. bei der künstlichen Befruchtung) sein. Die Ergebnisse können sowohl für die Human- als auch für die Veterinärmedizin wichtige Hinweise zum Verständnis der Biologie der Fortpflanzung geben.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008