Macromolecular modification of the cell wall of Gram-negative bacteria leading to antibiotic resistance and formation of outer membrane vesicles

Abstract

Membrane remodeling occurring in Gram-negative bacteria is a fundamental process involved in many aspects of bacterial physiology. Bacteria have evolved a variety of membrane modifications, e.g., outer membrane vesicles (OMVs), nanotubular membrane structures, lipopolysaccharide alteration, allowing them to better cope with a constantly changing, often hostile, environment. The overall goal of this dissertation was to investigate the influence of the macromolecular modification of the cell wall of Gram-negative bacteria on the development of antibiotic resistance and formation of outer membrane vesicles. One section of this work examines the phenomenon of the bacterial OMVs with respect to the mechanism underlying their formation and their contribution to antibiotic resistance. This research showed that all of the investigated opportunistic pathogens including Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii, Enterobacter sp., Escherichia coli and Serratia marcescens were able to continuously release vesicles into the surrounding milieu during in vitro growth. I validated that OMVs constitute an ubiquitous secretion system that may play a pivotal role in the transmission of enzymatically active compounds (e.g., active ß-lactamases), antibiotic resistance genes (e.g., KPC-2), and overall bacterial survival. However, the general mechanism underlying OMV formation still needs to be understood. Here, I demonstrated that the hemolysin F gene (hlyF), a putative virulence factor associated with highly virulent strains of avian pathogenic E. coli and neonatal meningitis E. coli, is involved in OMV formation. Overexpression of hlyF increased OMV production in E. coli and the presence of the truncated version of this gene led to a hypovesiculation phenotype. Therefore, hlyF appears to be part of a natural biological switch, regulating the vesiculation process in Gram-negative bacteria. Furthermore, I demonstrated that some clinical isolates of C. freundii may release OMVs acting as vehicles for transferring antibiotic resistance genes over longer distances. Field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) and transmission electron microscopy (TEM) visualized the shedding of DNA-containing OMVs. Exposure to OMVs derived from the carbapenemase gene KPC-2-containing donor cells resulted in gene transfer to E. coli. The second section of this work, focused on the modification of lipopolysaccharide (LPS), mediated by the plasmid-borne mcr-1 gene, leading to colistin resistance in Enterobacteriaceae. I established a methodology for purification of a full-length MCR-1 and showed an in vitro activity of this enzyme for catalyzing phosphoethanolamine (pEtN) hydrolysis from a lipid substrate. Lastly, I discovered that an optimized level of Ca2+ is required for the functionality of the mcr-1-mediated resistance. With this, I was able to develop a novel calcium-enhanced medium for the improved determination of Colistin resistance and the detection of mcr-1-producing Enterobacteriaceae. The medium devised here has been patented and a related patent application examining conditions associated with MCR-1 activity is ongoing. Modifikationen der Struktur der Membranen Gram-negativer Bakterien sind ein fundamentaler Prozess, der in vielen Aspekten der Bakterienphysiologie relevant ist. Bakterien haben eine Vielzahl von Membranmodifikationen entwickelt, wie z. B. äußere Membranvesikel (OMV), nanotubuläre Membranstrukturen und Lipopolysaccharid-Veränderung, die ihnen erlauben, mit einer ständig wechselnden und oft feindlichen Umwelt zurecht zu kommen. Das Ziel dieser Dissertation war es, den Einfluss der makromolekularen Zellwandmodifikation auf die Entwicklung der Antibiotikaresistenzen und die Bildung von äußeren Membranvesikeln von Gram-negativen Bakterien zu untersuchen. Ein Teil dieser Arbeit untersucht das Phänomen der bakteriellen OMV im Hinblick auf den Mechanismus, der ihrer Entstehung zugrunde liegt, und ihren Beitrag zur Antibiotikaresistenz. Diese Untersuchungen zeigten, dass alle getesteten opportunistischen Krankheitserreger, einschließlich Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii, Enterobacter sp., Escherichia coli und Serratia marcescens während des Wachstums in vitro kontinuierlich Vesikel in das umgebende Milieu freisetzen konnten. Ich konnte zeigen, dass OMV ein allgegenwärtiges Sekretionssystem darstellen, welches eine Schlüsselrolle bei der Übertragung von enzymatisch aktiven Verbindungen (z. B. aktiven ß-Lactamasen), Antibiotikaresistenzgenen (z. B. KPC-2) und dem gesamten bakteriellen Überleben spielen kann. Der allgemeine Mechanismus der OMV-Bildung muss jedoch noch verstanden werden. Hier konnte ich zeigen, dass das Hämolysin F Gen (hlyF), ein mutmaßlicher Virulenzfaktor, der mit hochvirulenten Stämmen von aviären E. coli und neonatalen Meningitis E. coli assoziiert ist, an der OMV-Bildung beteiligt ist. Die Überexpression von hlyF erhöhte die OMV-Produktion in E. coli und die Anwesenheit der verkürzten Version dieses Gens führte zu einem Hypovesikulations-Phänotyp. Daher scheint hlyF Teil eines natürlichen biologischen Regulators zu sein, der den Vesikulationsprozess bei Gram-negativen Bakterien steuert. Darüber hinaus habe ich gezeigt, dass einige klinische Isolate von C. freundii OMV als Vehikel für die Übertragung von Antibiotikaresistenzgenen über längere Distanzen fungieren können. Die Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-REM) und die Transmissions-elektronenmikroskopie (TEM) visualisierten die Freisetzung von DNA-haltigen OMV. Die Exposition gegenüber OMV, die aus den Carbapenemase Gen KPC-2-enthaltenden Spenderzellen stammen, führte zu einem Gentransfer in E. coli. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Modifikation des Lipopolysaccharids (LPS), verursacht durch das Plasmid-getragene mcr-1-Gen, was zu einer Colistinresistenz in Enterobacteriaceae führte. Ich etablierte eine Methode zur Aufreinigung eines vollständigen MCR-1 Proteins und zeigte eine in vitro Aktivität dieses Enzyms als Katalysator der Phosphoethanolamin (pEtN)-Hydrolyse eines Lipidsubstrats. Schließlich entdeckte ich, dass für die Funktionalität des mcr-1-vermittelten Widerstands ein optimiertes Niveau von Ca2+ erforderlich ist. Damit konnte ich ein neuartiges Calcium-supplementiertes Medium zur verbesserten Bestimmung der Colistin-Resistenz und der Identifizierung von mcr-1-produzierenden Enterobacteriaceae entwickeln. Das hier entwickelte Medium wurde patentiert, eine ähnliche Patentanmeldung ist geplant, die die hiermit verbundenen Zusammenhänge der MCR-1-Aktivität untersucht.