Ein wichtiger Schritt im mismatch Reparatur System (MMR) ist die Ausbildung des ternären Komplexes aus MutS, MutL und DNA nach der Erkennung der Fehlpaarung durch MutS. Dieser transiente Komplex soll in der Folge weitere Reparaturproteine aktivieren bzw. koordinieren. Zwar sind Kristallstrukturen für die einzelnen E. coli MMR Proteine MutS und MutL seit über 10 Jahren bekannt, nicht jedoch die Struktur des Komplexes. Eines der Hauptprobleme ist dabei die Dynamik des Komplexes. In der hier vorliegenden Arbeit wurden strukturelle und funktionelle Informationen zur ternären Komplexbildung der E. coli MMR Proteine MutS und MutL mit DNA erarbeitet und ein Strukturmodell erstellt. Die Methoden der Wahl waren dabei chemisches Modifizieren mit Fluoreszenzfarbstoffen und cysteinspezifisches Quervernetzen (crosslinking) von endogen vorhandenen oder durch zielgerichtete Mutagenese in MutS und MutL eingeführten Cysteinresten. Auf diese Weise wurden Positionen in den Proteinen bestimmt, die in der Nähe der Proteininteraktionsstellen von MutS bzw. MutL liegen. Ferner konnte der Komplex durch das chemische Quervenetzen stabilisiert werden, so dass der Komplex derzeit in hochauflösenden strukturellen Methoden, wie Kristallisation oder Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) analysiert werden kann.MutS besteht aus sieben Domänen. Es wurden Einzelcysteinvarianten mit einem Cysteinrest in jeweils einer dieser Domänen mit Ausnahme der C terminalen Dimerisierungsdomäne über zielgerichtete Mutagenese hergestellt. Mit Hilfe der Crosslinkexperimenten konnte zeigt werden, dass Positionen in der ATPase Domäne im N terminalen Fragment von MutL (Aminosäurereste 1 200), insbesondere die Positionen 131 und 135 in räumlicher Nähe zu den Positionen 8, 78 und 93 in der mismatch Bindungsdomäne (MBD, Aminosäurereste 1 115) von MutS liegen. Diese Crosslinkreaktionen sind offenbar hoch spezifisch, denn die Crosslinks zwischen MutS und MutL bilden sich nur unter Bedingungen aus, die für die ternäre Komplexbildung notwendig sind, d. h. in Anwesenheit von ATP und mismatch DNA.Ein weiterer kovalenter Komplex von MutS und MutL konnte erzeugt werden, wenn MutS Varianten eingesetzt wurden, in denen ein Cysteinrest entweder in der für die an der Interaktion beteiligten connector Domäne (116 266)2 oder in der strukturell angrenzenden core/levers Domäne (267 443 und 504 567) vorhanden ist. Interessanterweise war diese Crosslinkreaktion zwar DNA abhängig, konnte aber auch mit ADP anstelle von ATP beobachtet werden. Dieses Ergebnis war für die Erstellung eines Strukturmodells des MutS MutL Komplexes hilfreich, da im Gegensatz zur mismatch Bindungsdomäne die connector Domäne sowohl in Ab als auch in Anwesenheit von DNA und unabhängig von der Nukleotidbindung strukturell unverändert vorliegt. Ein weiteres wichtiges Ergebnis der vorliegenden Arbeit ist die mismatch und ATP induzierte interne Crosslinkreaktion von MutS zwischen Cys 93 in der mismatch Bindungsdomäne und Cys 239 in der connector Domäne. Dieses Resultat ist der erste direkte experimentelle Hinweis auf eine seit langem postulierte ATP induzierte Konformationsumwandlung der mismatch Bindungsdomäne weg von der DNA und hin zur connector Domäne.Die Crosslinkergebnisse konnten durch chemisches Modifizieren der Proteine und anschließende Funktionsanalysen von MutS und MutL, z. B. in der MutS/MutL abhängigen Aktivierung der Endonuklease MutH sowie durch analytische Ultrazentrifugationsstudien mit Fluoreszenzdetektion (in Zusammenarbeit mit Dr. Ute Curth, Hannover) bestätigt werden. Zum Schluss war es möglich, auf der Basis der vorhandenen Ergebnisse die mögliche Interaktionsstelle zwischen MutS und MutL präziser als bisher festzulegen. Allerdings ist es bislang nicht gelungen, über Protein Protein Docking, in silico ein Modell für die Interaktion zwischen MutS und MutL zu erstellen, da die Orientierung von MutL nicht ausreichend eingegrenzt werden konnte. Die vorhandenen Daten sind aber ein vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen.
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