Korrektur einer Insertionsmutation im porcinen ABCA4-Gen mit Hilfe des Prime Edit Systems

Abstract

Morbus Stargardt ist eine seltene, autosomal-rezessive vererbbare Erkrankung der Makularegion, die durch verschiedene Mutationen im ABCA4-Gen verursacht wird. Die jeweilige Mutation führt zu einem frühzeitigen Translationsabbruch des ABCA4-Transport-proteins, welches für den Abtransport von Stoffwechselendprodukten essenziell ist. Die Akkumulation dieser Abfallstoffe verursacht vor allem bei Zapfen-Zellen eine Degeneration, welche bei den Betroffenen häufig bereits im Jugendalter zu einer progredienten und starken Visusminderung führt. In dieser Arbeit wurde die Korrektur einer Insertionsmutation (c.5918_5919insA) innerhalb des porcinen ABCA4-Gens mithilfe des Prime Edit Systems, einem modifizierten CRISPR-Cas System, versucht. Hierbei kam die 2. Generation des Prime Edit Systems (PE2) sowie dessen 3. Generation (PE3/PE3b) zum Einsatz. Für das PE2-System wurden insgesamt 21 pegRNAs über das PrimeDesign Online-Tool ausgewählt und je in ein passendes Plasmid kloniert. Gemeinsam mit einem Plasmid, welches ein fusioniertes Enzym aus Cas9-Nickase und Reverse Transkriptase enthält und einem in der Arbeitsgruppe hergestellten BRET-Sensorplasmid, welches die mutierte Ziel-DNA enthält, erfolgte eine Dreifach-Transfektion in HEK293T-Zellen. Zur Generierung des PE3/3b-Systems wurden vier ngRNAs über selbiges Online-Tool ausgewählt, in je ein weiteres Plasmid kloniert und dem Versuchsaufbau des PE2-Sys-tems hinzugefügt, sodass eine Vierfach-Transfektion in HEK293T-Zellen erfolgte. Die Auswertung und Quantifizierung des Reparaturerfolgs durch die pegRNAs innerhalb des PE2- bzw. PE3/3b-Systems wurde jeweils mittels BRET-Assay durchgeführt. Die Reparatureffizienz der pegRNAs konnte durch Verwendung des PE3/3b-Systems im Vergleich zum PE2-System enorm gesteigert werden. Hier zeigte die Kombination aus pegRNA 26 und ngRNA 4 mit 91,2 % den höchsten Reparaturerfolg von allen Prime Editing Versuchsreihen. Die erzielten Ergebnisse indizieren, dass eine Korrektur der Insertionsmutation innerhalb des verwendeten BRET-Sensorplasmids mittels Prime Editing möglich ist. Besonders durch Verwendung einer zusätzlichen ngRNAs (PE3/3b-System) konnte im BRET-Assay eine hohe Editierungseffizienz nachgewiesen werden. Durch die flexible Gestaltung von pegRNAs sowie ngRNAs bietet Prime Editing bei nahezu jeder Mutation eine Korrekturmöglichkeit und ist anwendbar für verschiedenste Fragestellungen. Es zeigt großes Potenzial bei der Editierung großer Gene, welche nicht mittels klassischer Gentherapie durch virale Vektoren korrigiert werden können.