Der Effekt des Sertoli Zell-spezifischen Knockouts von Connexin43 auf die testikuläre Genexpression in der präpubertären Maus

Abstract

Connexine (Cx) sind die Proteinuntereinheiten der Gap Junction (GJ)-Kanäle. Sie werden von nahezu allen differenzierten Zellen des Körpers exprimiert. Durch die durch sie gebildeten Kanäle können Ionen, niedermolekulare Substanzen und Transmitter in die benachbarten Zellen gelangen. Dieser Stoffaustausch via Cx-geformter GJ ermöglicht die direkte Kommunikation und Koordination der Zellen eines Verbundes. Im Hoden ist Cx43 das vorherrschende GJ-Protein. Mäuse, denen das genannte Cx43-Gen nur in den Sertoli Zellen (SZ) des Hoden fehlt, sind lebensfähig aber infertil. Erwachsene Tiere zeigen eine stark veränderte Hodenmorphologie. Bei einer großen Zahl von SZ finden sich nur sehr wenige Keimzellen (KZ). Am Tag acht nach der Geburt wird die Spermatogenese bei Mäusen initiiert. Des Weiteren ist zu diesem Zeitpunkt die Morphologie des Hodens zwischen SCCx43KO-Mäusen und WT-Tieren grundsätzlich vergleichbar. Aus genannten Gründen wurde daher dieses Alter gewählt, um die vorliegende Studie durchzuführen.In der Arbeit wurde die Morphologie der acht Tage alten Keimdrüsen beider Genotypen analysiert und einander gegenüberstellt. Mit Hilfe der Microarray-Analyse konnte die Genexpression im Hoden der beiden Mäusestämme verglichen werden. Die Ergebnisse der Microarray-Untersuchung wurden mittels qRT-PCR verifiziert und ergänzt. Durch eine Pathway-Analyse konnten die signifikant regulierten Gene Signalwegen, Netzwerken und Canonical Pathways zugeordnet werden. Um zu überprüfen, ob sich die Veränderungen auf RNA-Ebene auch auf Proteinebene widerspiegeln, wurden für ausgewählte Gene Immunohistochemie (IHC) und Immunofluoreszenz (IF) durchgeführt. In den Hoden der acht Tage alten SCCx43KO-Tiere konnte eine deutlich geringere Anzahl von KZ als in den WT-Vergleichstieren detektiert werden. Hingegen ist kein Unterschied in der Morphologie und der Anzahl der SZ zu finden. Dies macht die Bedeutung von Cx43 für die KZ-Entwicklung deutlich, da auch bei adulten KO-Tieren ihre Anzahl reduziert ist und ihre Entwicklung nicht fortschreitet. Auf der anderen Seite lässt die bei adulten SCCx43KO-Mäusen erhöhte Zahl von adulten SZ je Keimtubulus in Zusammenhang mit einer erhöhten Amh-Expression an Tag acht p.p. auf eine verlängerte Proliferationsphase der SZ-Population schließen. In der Microarray-Analyse konnten 658 Gene als signifikant reguliert identifiziert werden: 135 von ihnen waren herauf- und 523 herunterreguliert. Die Pathway-Analyse zeigte, dass die veränderten Netzwerke und Signalwege zum allergrößten Teil nicht direkt mit Cx43 in Verbindung stehen. Unter den signifikant veränderten Genen fiel ein sehr großer Anteil KZ-spezifischer Gene auf. Auch nach Korrektur der Genexpressionsunterschiede um den Faktor (1/ØKZ-Zahl), den man durch die numerische Auswertung der Zellpopulationen im Hoden beider Genotypen erhalten hat, bleiben die Veränderungen signifikant. Zu diesen Genen zählten unter anderem Dazl, Stra8, Sox3 und Ovol1. Diese Erkenntnisse lassen den Schluss zu, dass die Deletion des Cx43-Gens in erster Linie Auswirkungen auf die KZ-Population hat, die von den SZ ernährt und gestützt wird. Ein weiteres Indiz ist durch die CX43-IHC gegeben. Sie zeigt, dass auch KZ kein Cx43-Protein zu translatieren scheinen, wenn kein Cx43-Connexon von den SZ bereitgestellt wird. Dies deutet darauf hin, dass kein anderes Cx in SZ in der Lage ist, mit Cx43 der KZ GJ-Kanäle zu bilden und somit deren Funktion nicht kompensiert werden kann. Zu dem untersuchten Zeitpunkt konnten praktisch keine Veränderungen der mit der Blut-Hoden-Schranke assoziierten Gene (z.B. Occludin), mit Ausnahme von Cx43 selbst, gefunden werden. Dadurch erscheint eine Rolle dieser Gene bei dem gefundenen, adulten Phänotyp zu diesem Zeitpunkt eher unwahrscheinlich. Mehrere signifikant regulierte Gene wie z.B. Stra8, Sox3 und Dazl konnten als essentiell für eine funktionelle Spermatogenese identifiziert werden und kommen somit als mögliche Mitverursacher des KZ-Defizits und der Spermatogenesestörungen in adulter SCCx43KO-Tiere in Betracht. Vergleichende Untersuchungen an humanen Hodenbiopsien mit verschiedenen Spermatogenesestörungen könnten zu weiteren Erkenntnissen beitragen.

Connexins (Cx) are expressed by nearly all differentiated cell types. They permit an exchange of ions, metabolites and signalling molecules. These exchanges via Connexin-formed Gap junctions allow the direct communication and coordination of cells within a tissue. In the testis Cx43 is the predominantly expressed gap junction protein. Mice lacking the Cx43-gene in Sertoli cells (SC) are viable but infertile. Adult animals show a severely altered testicular morphology with only a few differentiated germ cells and an increased number of SC. In mice, the initiation of spermatogenesis starts at about day eight p.p.. Furthermore, at that age the morphology of the testis is still comparable between SC-specific Cx43-knockout (KO)-mice and wild-type-mice. Therefore animals of this age where used for the present study.In this survey, morphology of the gonads at eight day old wild-type- and SCCx43KO-mice was analysed and compared. By Microarray analysis the gene expression in the testes of both genotypes were compared. The results of the Microarray analysis were verified and supplemented using qRT-PCR. Using Pathway analysis, significantly regulated genes could be assigned to Signalling pathways, networks and Canonical pathways. To test whether the alterations on mRNA-level are reflected on protein-level, Immunohistochemistry (IHC) and Immunofluorescence were performed. Results show, that the number of germ cells at day eight p.p. is reduced in the SCCx43KO-mice compared to the wild-type littermates. In contrast, there is no difference concerning the morphology and number of SC. On the one hand this result proofs the importance of Cx43 for germ cell development. On the other hand the increased number of SC in adult KO-mice concomitant with a higher Amh-expression in the present study and a prolonged time of Amh-expression in a former study points to alterations in SC maturation and proliferation. In the Microarray analysis 658 genes were identified as significantly regulated; 135 of them were up-regulated, while 523 were down-regulated. Pathway analysis showed that only very few of the signalling pathways and networks are directly correlated with Cx43. Furthermore a very high percentage of germ cell-specific genes were detectable among the significantly regulated genes like Dazl, Stra8, Sox3 and Ovol1. They kept to be significantly regulated even after the adjustment by the differing number of germ cells using a correction factor (1/Øgerm cell number). These findings permit the conclusion that the deletion of Cx43 primarily effects the germ cell population, which is supported by the nursing SC. Evidence maybe given by the Cx43-IHC in adult SCCx43KO-mice, as there the germ cells seem not to be able to translate Cx43-protein, if there is no Cx43-connexon provided by the SC. This leads to the conclusion that there is no other Cx in SC being able to form functional gap junction-channels with the Cx43-connexons of the germ cells (and vice versa). Therefore the function of Cx43 cannot be compensated or replaced. At the time of development investigated in this study almost no alterations in genes involved in the formation of the blood-testis-barrier, apart from Cx43 itself, could be observed. Several significantly regulated genes, for example Stra8, Sox3 and Dazl could be detected as candidate genes which may be involved in the observed germ cell deficiency and disturbance of functional spermatogenesis in adult SCCx43KO-mice. Comparative studies of these genes using human testicular biopsies with different kinds of impaired spermatogenesis might be able to provide further information.