Biotechnologische Gewinnung von Cyathan-Diterpenoiden

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Basidiomyceten produzieren vielfältige biologisch aktive Sekundärmetabolite, unter anderem seltene niedermolekulare Terpenoide, welche ein enormes Potenzial in der pharma¬zeutischen Industrie besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden Unter¬suchungen zu Cyathan-Diterpenoiden aus den Basidiomyceten-Arten Cyathus striatus (FU04405) und Hericium erinaceus (FU70034) durch-geführt. Letzterer ist als Produzent von verschiedenen Erinacinen bekannt. Die Erinacin C-Produktion war bei dem verwendeten Stamm stark substrat¬abhängig. Das ZM1/2-Medium mit 0,5 g L-1 Edamin® K erwies sich dafür als am besten geeignet. Die maximale Konzentration an Erinacin C betrug ca. 257 mg L-1 Medium mit einer Kultivierungs¬dauer von 9 Tagen. Die Produktion von Erinacin P war stark zeit¬abhängig. Die maximale Konzentration von 184 mg L-1 Medium wurde am Tag 3 erreicht. Eine UV-A-Bestrahlung während der Kultivierung wirkte sich sowohl auf das Biomasse¬wachstum, als auch auf die Bildung der Erinacine negativ aus. Des Weiteren wurden die Striatale A/B/C/D und die Striatine A/B aus Submers-kulturen von C. striatus isoliert. Aus Submerskulturen von H. erinaceus wurden die Erinacine C/F/P, 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzoesäure (neu entdeckter Metabolit), eine unbekannte Substanz mit der Summenformel C18H21NO5 und vier unbekannte Meroterpenoide C27H29NO7, C42H50N2O12, C24H31NO7 und C23H29NO7 (neu entdeckte Metaboliten) isoliert. Aus den Fruchtkörpern von H. erinaceus wurden Hericenon B und Hericerin isoliert. Mittels MALDI-MS-Imaging konnte nachgewiesen werden, dass die Striatale und Erinacine innerhalb eines Pellets lokalisiert sind. Durch den Einsatz einer kontinuierlich arbeitenden Rührwerkskugelmühle zum Zellaufschluss konnten die Produktausbeuten um 89% (Striatale A und B) bzw. um 53% (Erinacin C) gesteigert werden. Für die untersuchten Basidiomyceten erwies sich damit der Zellaufschluss mittels Rührwerks¬kugelmühle zur Freisetzung der Sekundär-metabolite als hocheffizient. Darüber hinaus wurde ein indirekt kompetitiver ELISA zum Nachweis der Cyathan-Diterpenoide entwickelt. Verschiedene Einflussfaktoren auf den Assay wie pH Wert, Temperatur, Dauer der Beschichtung sowie die Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln wurden untersucht. Die Kreuzreaktivitäten der Striatale A/C/D, der Striatine A/B und der Erinacine C/P gegen Striatal B wurden ebenfalls ermittelt. Zusätzlich wurde der hier etablierte ELISA in biologischen Proben zum Screening nach Cyathan-Derivaten eingesetzt. Dabei wurden Kreuz¬reaktivitäten in den Rohextrakten der Kulturüberstände aus Submerskulturen von H. erinaceus nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigte ein Rohextrakt aus Fruchtkörpern von H. erinaceus keine signifikante Antigen-Antikörper-Reaktion. Anhand der Wieder¬findungs¬rate konnte eine hohe Sensitivität, eine ausreichende Genauigkeit und eine gute Korrelation des ELISA mit den HPLC-DAD-Messungen aufgezeigt werden.Mittels HPTLC wurden vergleichbare Ergebnisse bezüglich Produktbildungskinetik wie mit Hilfe der HPLC erzielt. Die HPTLC bietet zusätzlich die Möglichkeit, die Sekundärmetabolite über die Bioautographie auf Bioaktivität zu überprüfen.

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