Schnelle und einfache Bestimmung der Genotypen des Hepatitis B Virus durch eine Multiplex-PCR

Abstract

Das Ziel der Arbeit war es eine einfache und zeitsparende Methode zu etablieren, die in der Lage war, die heute bekannten siebenGenotypen des Hepatitis B Virus zu erkennen. Zu Beginn der Arbeit wurde versucht eine publizierte Methode zu verbessern. Bei derverwendeten Multiplex-PCR wurden die HBV-Genotypen A, C, D und F diskriminiert. Nach unveröffentlichten Ergebnissen sollte auch nochder Genotyp E erkannt werden. Um diese Multiplex-PCR zu verbessern, wurde ein spezifischer Primer für den Genotypen B getestet. Zwargelang der spezifische Nachweis eines Genotyp-B-Isolates wodurch alle zum damaligen Zeitpunkt bekannten Genotypen A-F in einerMultiplex-PCR nachweisbar waren; aber die Methode erwies sich für die Routinediagnostik als zu störungsanfällig. Deshalb wurde mit einem etwas anderen methodischen Ansatz eine neue Multiplex-PCR entwickelt, die in einem Reaktionsansatz dieheute gängigen sieben HBV-Genotypen zu differenzieren vermochte. Mit Hilfe verschiedener Computerprogramme wurden siebenPrimerpaare entwickelt, die die gleiche vorhergesagte Annealingtemperatur aufwiesen. In umfangreichen Experimenten wurden dann dieverschiedenen Parameter wie Annealing- und Elongationstemperaturen, Zykluszeiten, verschiedene Thermocycler sowie verschiedenehitzestabile Polymerasen optimiert. Unter den gefundenen Bedingungen erwies sich die Multiplex-PCR als hochspezifisch. EineGenotypisierung gelang nicht nur mit HBV-DNA haltigen Plasmiden, sondern auch in einer kleinen Auswahl von Patientenseren mit durchSequenzierung bekanntem Genotyp. Auch die Empfindlichkeit des System war mit 103-104 Genomäquivalenten pro ml befriedigend. Nunmehr steht ein System zur Verfügung, welches seinem Ziel - der einfachen und schnellen HBV-Genotypisierung gerecht wird.