Nachweis des Platelet-activating factor (PAF) in der bovinen Plazenta anhand der Expression des PAF-Rezeptors und der zugehörigen PAF-Azetylhydrolasen
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Zusammenfassung
Platelet-activating factor (PAF) gehört der großen Familie der Wachstumsfaktoren an und wurde häufig im Zusammenhang mit Angiogenesevorgängen beschrieben. Da sich die Plazenta besonders gut zum Studium von Wachstums- und Angiogenesevorgängen eignet, befasst sich diese Arbeit mit der Frage, ob PAF in der bovinen Plazenta, die sich durch eine eingeschränkte Invasion von Trophoblastriesenzellen auszeichnet, eine Rolle spielt. PAF wurde indirekt über die Expression des PAF-Rezeptors (PAF-R) sowie die inaktivierenden PAF-Azetylhydrolasen (PAF-AH) in der bovinen Plazenta nachgewiesen. Die untersuchten Plazentome aus der Rinderplazenta deckten den gesamten Zeitraum der Trächtigkeit vom Tag 30 der Gravidität bis unmittelbar vor den Geburtseintritt ab. Dieses Material wurde parallel schockgefroren beziehungsweise mit Bouin scher Lösung/Formalin fixiert. Sowohl der PAF-R als auch die PAF-AH-Isoformen wurden auf mRNA- und Proteinebene mit den Methoden RT-PCR, in situ Hybridisierung und Immunhistochemie erfolgreich nachgewiesen. Für das Enzym PAF-AH wurde zusätzlich ein Aktivitätsassay durchgeführt. Der PAF-R wurde während der gesamten Gravidität in der bovinen Plazenta detektiert. Im Verlauf der Gravidität wiesen die unreifen Trophoblastriesenzellen (TGC) die höchste Expression des PAF-R auf. Je größer und reifer die TGC wurden, desto geringer wurde die Expression sowohl der mRNA als auch der des Proteins im Gewebe. Das Karunkelepithel sowie die Endothelzellen der maternalen und fetalen Gefäße exprimierten ebenfalls den PAF-R, die Expressionsstärke blieb jedoch zu jedem Zeitpunkt der Gravidität deutlich hinter der der TGC zurück. Dagegen verschob sich kurz vor dem Eintritt der Geburt die Lokalisation der mRNA wie auch des Proteins des PAF-R. Zu diesem Zeitpunkt zeigten nur noch wenige unreife TGC äußerst schwache Signale, wohingegen im maternalen Stroma und hier besonders in den Endothelien der Gefäße deutliche Signale in der in situ Hybridisierung und der Immunhistochemie erfasst wurden. Die PAF-Azetylhydrolasen zeigten ein ähnliches Expressionsmuster in der in situ Hybridisierung und der Immunhistochemie wie der PAF-R. Auch hier wurden die gleichen Unterschiede, wie bei der Untersuchung des PAF-R, bezüglich der Lokalisation der PAF-AH im Verlauf der Trächtigkeit im Vergleich zum Zeitpunkt kurz vor der Geburt beobachtet. Die mRNA sowie das Protein der PAF-AH waren bei Plazentomen, die den Zustand während der Gravidität repräsentierten, hauptsächlich in unreifen TGC lokalisiert. Die Signalintensität im Karunkelepithel und den Gefäßendothelien war deutlich geringer ausgeprägt. Zum Zeitpunkt kurz vor der Geburt wurde, wie schon beim PAF-R, ein Wechsel der Signale hin zum Karunkelepithel und maternalen Stroma beobachtet. Nur noch sehr wenige TGC zeigten eine schwache Immunreaktion für PAF-AH, wogegen der Hauptanteil der mRNA und des Proteins im maternalen Kompartiment zu finden war. Die Aktivität des Enzyms PAF-AH zeigte keine statistisch signifikanten Veränderungen im Verlauf der Gravidität des Rindes. Hierbei ist aber zu beachten, dass die eingesetzten Proben aus ganzen Plazentomen bestanden, die Untersuchung also mögliche Verschiebungen der Aktivität zwischen den einzelnen Kompartimenten nicht erfasste. Wie oben beschrieben kommt es zu einem Wechsel der Expression der PAF-AH kurz vor der Geburt in das maternale Kompartiment, aus diesem Grund ist es wahrscheinlich, dass die PAF-AH-Aktivität im fetalen Anteil der Plazenta zur Geburt hin abnimmt, im maternalen Anteil im entsprechenden Maß ansteigt und daher die Gesamtaktivität dieses Enzyms im Vergleich zu den Werten während der Gravidität keinen messbaren Veränderungen unterliegt. Der PAF-R sowie die PAF-AH konnten erfolgreich in der Rinderplazenta lokalisiert werden. Daher kann man sicher davon ausgehen, dass auch PAF in der bovinen Plazenta vorhanden ist. Die spezifische Lokalisation des PAF-R und der PAF-AH in den unreifen TGC lässt den Schluss zu, dass PAF möglicherweise eine Rolle im Rahmen der Entwicklung und Differenzierung der TGC spielt. Weiterhin könnte PAF, eventuell im Zusammenspiel mit anderen Wachstumsfaktoren, die plazentare Angiogenese stimulieren und/oder allgemein als Wachstumsfaktor wirken. Der Wechsel des Expressionsmusters des PAF-R und der PAF-AH in das maternale Stroma zum Zeitpunkt des Geburtseintritts könnte ein Anzeichen dafür sein, dass PAF bei geburtsrelevanten Vorbereitungen der Plazenta, wie der Regulation der Wehentätigkeit und der postpartalen Regression des Uterus, regulierend mitwirkt.
Platelet-activating factor (PAF) belongs to the large group of growth factors and is involved in angiogenic processes. Since the placenta is a fast growing organ it is highly qualified for studies concerning growth and angiogenesis. The aim of the study was to determine whether or not PAF could play a role for growth and angiogenesis in the bovine placenta. Special reference was paid to the phenomenon of the restricted trophoblast invasion, where migrating trophoblast giant cells (TGC) fuse with uterine epithelial cells. PAF action in the bovine placenta was demonstrated indirectly by the detection of the PAF-receptor (PAF-R) and the PAF-acetylhydrolases (PAF-AH), covering gestational ages from day 30 until term and immediately prepartum. The tissue samples were either fixed with bouin s solution/formalin or shock-frozen in liquid nitrogen. mRNA and protein of the PAF-R and PAF-AH were analyzed by RT-PCR, in situ hybridization and immunohistochemistry. The PAF-AH activity was additionally determined with a commercially available assay. PAF-R was found in the bovine placenta throughout gestation. During gestation the immature TGC were the cells with the strongest expression of PAF-R. With increasing maturity, the expression of protein and mRNA of PAF-R in the TGC decreased. Uterine epithelial cells and endothelial cells of fetal and maternal vessels showed signals for the PAF-R as well, but the expression was much weaker than in the TGC. Immediately prepartum the localization of protein and mRNA of PAF-R changed. Only few TGC remained to produce PAF-R mRNA and protein. In contrast, distinct signals were seen in cells of the maternal stroma, predominantly in endothelial cells. The expression pattern of mRNA and protein of PAF-AH was similar to that of the PAF-R during gestation and immediately prepartum. During gestation mRNA and protein of PAF-AH were mainly observed in immature TGC and to lesser extent in maternal epithelial cells and in fetal and maternal vascular endothelium. In placentomes taken immediately prepartum the expression of PAF-AH switched into the maternal stroma and uterine epithelium. Only few TGC were PAF-AH-positive, and the majority of PAF-AH mRNA and protein was localized in the maternal compartment. The PAF-AH activity showed no statistically significant changes throughout gestation. However, it has to be noted that the PAF-AH activity assay was performed with whole placentomes, and thus included fetal and maternal compartment. Therefore, potential changes and differences in the degree of the PAF-AH activity between both compartments of the bovine placenta were not detected. As mentioned above, the expression of PAF-AH changed its localization from fetal to maternal site of the bovine placenta at the onset of parturition. So it is possible that the activity in the fetal compartment decreased to the same extent as the activity increased in maternal part of the placenta, meaning that the total PAF-AH activity would remain equal throughout gestation. PAF-R and PAF-AH were successfully localized in the bovine placenta. Therefore, we may assume that PAF is also present in the bovine placenta. The specific localization of PAF-R and PAF-AH in immature TGC suggests a role for PAF in TGC programming and differentiation. Furthermore, PAF may be implicated in angiogenic processes on its own or in interaction with other growth factors. The parturition-related switch to the maternal stroma implies the involvement of PAF in the regulation of parturition, specifically labor or the postpartum regression of the uterus.