Regulation and role of Notch signaling in epithelial progenitor cell differentiation and proliferation in the normal and the fibrotic lung

Abstract

It is increasingly accepted that the alveolar epithelial cell plays a major role in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), a dismal disease with an average survival time of ~ 3 years and a progressive decline in lung function and exercise capacity. In IPF, chronic injury of alveolar type II cells (AECII) seems to cause disturbed alveolar re-epithelialization (1). It appears that profoundly increased epithelial apoptosis, which occurs due to epithelial injury, causes accelerated epithelial cell proliferation and further apoptosis (2, 3 and 4). The Notch signaling functions as a mediator of a cell-cell communication. The Notch pathway is known to be involved in proliferation, cell death, stem cell maintenance and differentiation during embryonic and adult development (5-8). In addition the Notch network has already been identified to play a role in some chronic lung diseases such as COPD or PAH (9, 10). Until now, the Notch signaling pathway has not been investigated in IPF. In particular, the impact of Notch activation on alveolar epithelial proliferation and apoptosis has yet not been analyzed. The present study was undertaken to evaluate the regulation and the potential role of Notch activation in repair processes in IPF lungs. We investigated the cellular regulation of the Notch signaling pathway on mRNA, protein and immunohistochemical level (IPF vs. donor lungs; bleomycin-treated vs. control mice lungs). Proliferation and survival of an AECII and AECII-like cell line (MLE 12) was investigated after in vitro transfection with Notch1 ICD, POFUT1 siRNA and DAPT (γ-secretase inhibitor) treatment. Our transcriptome data proved differential regulation of the Notch signaling pathway in microdisected septae from still normal appearing areas (representative of the early-stage of the disease) of IPF lungs compared to septae of healthy organ donors. On protein level, no significant changes in the expression of Notch pathway elements were observed with the exception of the intracellular domain of Notch1 receptor (NICD1), the ligand DLL1 and the downstream target Hes1, which were found to be significantly increased in IPF vs. donor lungs. We also observed increased protein levels of NICD1 and Dll1 in lungs of bleomycin-treated mice. Expression of these proteins was mainly restricted to AECII of fibrotic lungs. Moreover on the IHC level, expression of NICD1 and DLL1 proteins seems to be increased in AECII in IPF as compared to controls. Furthermore, we observed a characteristic staining pattern, where subpopulation of AECII cells expressed Notch1 in cytoplasm and neighboring AECII cell showed localization of this receptor in the nucleus. Most importantly, observations made after NICD1 overexpression or Notch pathway inhibition in the MLE 12 alveolar epithelial cell line and mouse primary AECII cells isolated from bleomycin-challenged mice indicate that Notch plays a major role in uncontrolled AECII proliferation in vitro. In addition, there was no influence of the Notch signaling pathway on epithelial apoptosis. Furthermore, genome wide mRNA microarray analysis of NICD1-overexpressing MLE 12 cells revealed differential regulation of the MAPK pathway. We found that NICD1 overexpression in MLE 12 cells induced phosphorylation of Erk5. Therefore, we can speculate that Erk5 may be a downstream effector of Notch1 activation, involved in increased alveolar epithelial cell proliferation. Our findings demonstrate for the first time a potential role of the Notch signaling pathway in the re-epithelialization process in the lung, which may indicate involvement of Notch on pathogenesis of pulmonary fibrosis. Es findet zunehmend Akzeptanz, dass die alveolaren Epithelzellen eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der idiopathischen pulmonalen Fibrose (IPF) spielen, einer prognostisch ungünstig verlaufenden Krankheit mit einer medianen Überlebenszeit von etwa 3 Jahren und einer fortschreitenden Abnahme der Lungenfunktion und Belastbarkeit. Bei der IPF scheint eine chronische Schädigung der alveolaren TypII Zellen (AECII) eine gestörte alveolare Reepithelisierung zu verursachen (1). Anscheinend bewirkt stark vermehrte Apoptose, hervorgerufen durch Schädigung des Epitheliums, beschleunigte Epithelzellvermehrung und weitere Apoptose (2, 3 und 4). Die Notch-Signalkaskade fungiert als Vermittler der Zell-Zell-Kommunikation. Bekanntermaßen ist der Notch-Signalweg in Proliferation, Zelltod, Stammzellerhaltung und -differenzierung während der embryonalen und adulten Entwicklung involviert (5-8). Des Weiteren spielt er eine Rolle bei einigen chronischen Lungenerkrankungen, wie COPD oder PAH (9, 10). Bisher wurde die Rolle des Notch-Signalwegs im Zusammenhang mit der IPF, insbesondere der Einfluss der Notch-Aktivierung auf die Proliferation und Apoptose der alveolaren Epithelzellen, noch nicht analysiert. In der vorliegenden Arbeit sollte die Regulation und die mögliche Rolle der Notch-Aktivierung bei Regenerationsprozessen in IPF Lungen untersucht werden. Die zelluläre Regulation des Notch-Signalwegs wurde auf mRNA- und Proteinebene sowie auf immunhistochemischer Ebene untersucht (IPF vs. Donorlungen; Lungen von Bleomycin-behandelten Mäusen und Kontrollen). Proliferation und Überleben von AECII und einer AECII ähnlichen Zelllinie (MLE 12) wurden nach in vitro Transfektion mit Notch1 ICD, POFUT1 siRNA und nach Behandlung mit einem γ-Sekretase-Inhibitor (DAPT) untersucht. Anhand unserer Transkriptomdaten konnten wir unterschiedliche Regulation des Notch-Signalwegs in Septen (durch Mikrodissektion erhalten) normal erscheinender Bereiche von IPF Lungen (einem frühen Krankheitsstadium der IPF entsprechend) im Vergleich zu Septen gesunder Spenderlungen nachweisen. Auf Proteinebene konnten wir keine signifikanten Unterschiede in der Expression von Bestandteilen der Notch-Signalkaskade feststellen, mit Ausnahme der intrazellulären Domäne des Notch1 Rezeptors (NICD1), des DLL1 Liganden und des downstream target Hes1, welche im Vergleich zu Donorlungen in IPF Lungen signifikant erhöht waren. Ebenso zeigten sich auf Proteinebene erhöhte Werte von NICD1 und Dll1 in Lungen von Bleomycin-behandelten Mäusen. Die Expression dieser Proteine war hauptsächlich auf AECII fibrotischer Lungen beschränkt. Im Vergleich zu Spenderlungen scheint die Expression von NICD1 und DLL1 auf immunhistochemischer Ebene in IPF-Lungen erhöht zu sein. Des Weiteren beobachteten wir ein charakteristisches Färbemuster, bei dem ein Teil der AECII Notch1 im Zytoplasma exprimierte, während bei benachbarten AECII dieser Rezeptor im Nukleus lokalisiert war. Wesentlich sind Beobachtungen nach Überexpression von NICD1 oder Inhibition der Notch-Signalkaskade in der MLE 12 Zelllinie und in von Bleomycin-behandelten Mäusen isolierten AECII, die zeigen, dass Notch in vitro eine wichtige Rolle in der unkontrollierten Proliferation von AECII Zellen spielt. Der Notch Signalweg hatte keinen Einfluss auf die Apoptose der Epithelzellen. Weiterhin zeigte eine genomweite mRNA-Analyse mit Mikroarrays von NICD1 überexprimierenden MLE 12 Zellen differenzielle Regulation des MAPK Signalwegs. NICD1-Überexpression in MLE 12 Zellen induzierte eine Erk5-Phosphorylierung. Daher können wir vermuten, dass Erk5 ein in die erhöhte Proliferation der alveolaren Epithelzellen involvierter Downstream-Effektor der Notch1 Aktivierung ist. Unsere Ergebnisse zeigen erstmals eine mögliche Rolle des Notch-Signalwegs in Reepithelisierungsprozessen der Lunge. Dies könnte auf eine Beteiligung von Notch an der Pathogenese der pulmonalen Fibrose hindeuten.