Rolle des NO/cGMP-Signalweges bei der Regulation des kontraktilen Apparates von porcinen Endothelzellen
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Zusammenfassung
Der kontraktile Apparat spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulation der endothelialen Schrankenfuntion. Die Aktivierung des kontraktilen Apparates wird dabei durch den Phosphorylierungsgrad der kleinen regulatorischen Untereinheiten des Myosins bestimmt. Dieser wiederum unterliegt der Kontrolle zweier Enzyme des kontraktilen Apparates: Myosinleichtkettenphosphatase (MLKPase) und MLK-Kinase (MLKK). Manöver, die die Konzentration des intrazellulären Botenstoffes NO/cGMP steigern, stabilisieren die endotheliale Schrankenfunktion. Der Mechanismus dieser schrankenprotektiven Wirkung wird bisher nur teilweise verstanden. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob NO/cGMP den kontraktilen Apparat der Endothelzellen beeinflusst und damit die Schranke stabilisiert. Im Zentrum stand dabei die Regulation der MLK-Kinase und MLK-Phosphatase.Die Experimente wurden an kultivierten porcinen Aortenendothelzellen durchgeführt. Dabei wurde der Phosphorylierungsgrad der MLK unter Einfluss verschiedener enzymatischer Aktivatoren bzw. Inhibitoren bestimmt. Des Weiteren wurden die Permeabilität und die kontraktile Aktivierung der Endothelzellschichten über deren Albumindurchlässigkeit sowie isometrische Kraftentwicklung gemessen. Zusätzlich wurde die Translokation der katalytischen Untereinheit, PP1, an Myosin dargestellt, und die zytosolische Ca2+-Konzentration mittels eines fluoreszierenden Ca2+-Indikators bestimmt.Die Zugabe des NO-Donors DEA-NONOate (50 µM) verursachte sowohl eine starke Abnahme der MLK-Phosphorylierung, als auch eine deutliche Abnahme der isometrischen Kraft und Permeabilität der Endothelzellen. In Gegenwart des PKG-Inhibitors RP-8-pCPT-cGMPS (50 µM) wurden sämtliche NO/cGMP-Effekte auf die untersuchten Parameter wieder aufgehoben. YC-1 (20 µM), ein Aktivator der löslichen Guanylyzyklase sowie Sp-8-Br-PET-cGMPS (50 µM), ein direkter Aktivator der PKG, zeigten analoge Wirkungen wie DEA-NONOate, die unter Einfluss von RP-8-pCPT-cGMPS (50 µM) ebenfalls wieder aufgehoben wurden. Bei vollständiger pharmakologischer Hemmung der MLK-Kinase durch ML-7 (50 µM) verstärkte NO/cGMP die Wirkung von ML-7 auf die MLK-Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu wurde durch vollständige pharmakologische Hemmung der MLK-Phosphatase durch Calyculin A (10 nM) die dephosphorylierende Wirkung von NO/cGMP aufgehoben. Dies spricht dafür, dass NO/cGMP über Aktivierung der MLK-Phosphatase und nicht über Hemmung der MLK-Kinase die MLK-Phosphorylierung reduziert. In Übereinstimmung damit konnte gezeigt werden, dass DEA-NONOate eine Translokation der PP1-Untereinheit an Myosin induziert. Die zytosolische Ca2+-Konzentration änderte sich unter NO/cGMP-Einfluss nicht.In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass NO/cGMP in aortalen Endothelzellen die MLK-Phosphatase aktiviert. Die Aktivierung erfolgt über einen NO/cGMP/PKG-abhängigen Mechanismus und bewirkt eine Translokation der PP1 an Myosin. Die resultierende Dephosphorylierung der MLK führt zu einer Hemmung des endothelialen kontraktilen Apparates und schließlich zu einer Abnahme sowohl der isometrischen Kraftentwicklung als auch der Permeabilität des Endothels. Dieser Prozess ist Ca2+-unabhängig.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
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Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler