Gene expression of the testis-specific histone (H1t) in the spermatogenesis of the stallion
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Zusammenfassung
Die Sequenz des H1t Gens der Spezies Maus, Ratte, Affe und Mensch ist bereits bekannt. Beim Pferd war die H1t Sequenz bisher unbekannt. Durch Bioinformatikanalysen wurden Primer aus dem mit Maus, Ratte, Affe und Mensch größten homologen Bereich des H1t ausgewählt. Aus equinem Hodenhomogenat wurde eine Nested PCR durchgeführt, das Produkt sequenziert und anschließend kloniert. Die partielle H1t Sequenz des Pferdes ist in der Genbank eingetragen (Accession AJ865320). Die mRNA Expression konnte durch Reverse Transkriptase PCR (RT- PCR) in Hodenhomogenaten sowie durch eine Digoxigenin-markierte H1t-mRNA Sonde mittels In-situ Hybridisierung an Paraffinschnitten nachgewiesen werden. Es hat sich gezeigt, dass in der normalen Spermatogenese H1t mRNA in spermatogonien and in frühen bis mittleren pachytänen Spermatozyten exprimiert wird. Aus einer Protein-Protein-Sequenz Homologie (ClustalW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) zwischen Maus, Ratte, Affe und Mensch wurde aus dem nicht konservierten Bereich eine Sequenz ausgesucht, um einen polyklonalen Antikörper herstellen zu lassen. Das H1t Protein ist durch Western Blot in der normalen Spermatogenese am Hodenhomogenat mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers gegen H1t Peptid LITEALSVSQER identifiziert und sequenziert worden (Peptidmassen Fingerprint Analyse mit MALDI MS/MS). Das Protein hat ein Molekulargewicht von 29 kDa. In einem Expressionsprofil mit verschiedenen equinen Organen wurde festgestellt, dass H1t hodenspezifisch ist. Im kryptorchiden Hoden zeigt das Keimepithel verschiedene Entwicklungsstadien der Keimzellen, die mit dem einen fetalen Hoden vergleichbar sind. Es handelt sich hier um Tubuli, in denen nur fetale Präspermatogonien und Spermatogonien vom Typ A vorhanden sind. Im präpubertären Hoden kann man Tubuli mit Keimzellen bis zur Stufe der frühen pachytänen Spermatozyten beobachten. Zum Nachweis des H1t Proteins wurde ein Western Blot durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Proteinexpression im Hodenhomogenat mit normaler Spermatogenese sehr stark ist. Dagegen gibt es kein Signal im Hodenhomogenat mit einem Arrest der Spermatogenese auf der Stufe von Spermatogonien in kryptorchiden Hoden. Im präpubertären Hoden konnte die Expression des H1t Proteins in frühen Spermatozyten nachgewiesen werden. Die Immunhistochemie zeigt in adulten Tieren ein starkes Signal im Zellkern von Primärspermatozyten bis hin zu runden Spermatiden. Um diese Ergebnisse auf mRNA Ebene quantitativ nachzuweisen, wurde eine Real-Time PCR durchgeführt. Die H1t mRNA wird in frühen Spermatozyten hochreguliert. Die bisherigen Daten zeigen, dass ebenso wie bei der Maus, das equine H1t auf RNA Ebene in geringen Mengen bereits in Präspermatogonien exprimiert und mit dem Beginn der Meiose hochreguliert wird. Bezüglich der Subfertilität des Hengstes wurde die Untersuchung mittels RT-PCR und Real Time PCR altersabhängig (& #8804; 2 Jahre und & #8805; 3 Jahre) untersucht. Die Real-time RT-PCR zeigte eine Zunahme der H1t mRNA Expression in einem großen Bereich individueller Variabilität zwischen drei und vier Jahre alten Tiere und eine stabile Expression bei Tieren, die älter als vier Jahre sind. Das H1t Protein wurde in Hoden mit der Initiierung der Spermatogenese und dem Erscheinen von primären Spermatozyten durch Western Blot detektiert. Die Zell-Proteinexpression mittels Immunhistochemie hat eine Verlängerung der H1t Proteinexpression in präpubertären Hoden von zwei Jahre alten Tieren ergeben. Diese Studien deuten darauf hin, dass zwischen der H1t Geneexpression und der "Subfertilität" während der Spermatogenese des Hengstes ein Zusammenhang besteht.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008