Charakterisierung des Eimeria bovis Mikronemenproteins 4 (EbMIC4) und erste Studien zur Modulation des Wirtszell-Proteoms durch Eimeria bovis

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2008

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10114

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Eimeria bovis ist ein intrazellulärer Darmparasit und einer der pathogensten Erreger der bovinen Kokzidiose. Während der endogenen Entwicklung kommt es in der ersten Merogonie in vivo zur Bildung kleiner gleich 300 mym großen Makromeronten im Verlauf von > 2 Wochen. Als Mitglieder der Apikomplexa besitzen alle invasiven Stadien spezielle Organellen und Strukturen, die in ihrer Gesamtheit als Apikalkomplex bezeichnet werden. Die Mikronemen stellen spezialisierte sekretorische Organellen dieses Komplexes dar, die ihre Proteine bei einer stimulierten Exozytose sezernieren. Die Mikronemenproteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Fortbewegung des Parasiten und der Invasion einer Wirtszelle. Mitglieder dieser Proteinfamilie stellen Verbindungsglieder zwischen der Oberfläche der Wirtszelle und dem Aktinomyosinmotor des Parasiten dar. Ein Ziel dieser Studie war die Charakterisierung von E. bovis-spezifischen Mikronemenproteinen. Mittels verschiedenster Methoden wurde eine genomische DNA-Sequenz (single copy-Gen) mit ca. 8700 bp identifiziert. Die kodierende Sequenz, verifiziert über RT-PCR, umfasst 5481 bp. Die vorhergesagte Proteinsequenz besteht aus 1827 aa, mit einem MW von 191,45 kDa und einem pI von 4,14. Homologievergleiche sprechen für ein homologes Protein zum Mikronemenprotein 4 von Eimeria tenella (EtMIC4). Charakterisiert als Transmembranprotein der TRAP Proteinfamilie, beinhaltet es im extrazellulären Anteil 31 epidermal growth factor- ähnliche Domänen, die von Bereichen mit Thrombospondin-1-Domänen eingerahmt werden. Daneben zeichnet sich EbMIC4 durch eine hochkonservierte Transmembrandomäne sowie einen kurzen zytoplasmatischen Teil mit konservierten Tyrosin- und Tryptophanresten aus. Außerhalb der Apikomplexa besteht eine hohe Ähnlichkeit zur Proteingruppe der Fibrilline. Vergleichende Analysen mit anderen Mikronemenproteinen zeigten, dass EbMIC4 viele Gemeinsamkeiten mit diesen Proteinen besitzt. Sequenzbereiche, die für den gerichteten Transport zu den Mikronemen bedeutend sind, waren genauso konserviert wie potentielle Phosphorylierungsstellen oder bestimmte Aminosäuren. EbMIC4 wurde bei beiden invasiven Stadien, Sporozoiten und Merozoiten I, vor allem im apikalen Bereich nachgewiesen. Im Gegensatz zum hier ebenfalls klonierten Ebhsp70, das über die gesamte Entwicklungszeit konstitutiv transkribiert wurde, zeigte sich bei Ebmic4 ein differenzierteres Bild. Anfangs im intrazellulären Sporozoiten noch deutlich nachweisbar, war das Transkript von Ebmic4 ab dem 4./5. Tag p. i. nur noch in geringen Mengen vorhanden. Mit dem ersten Auftreten von immaturen Meronten (ca. 10./12. Tag p. i.) stiegen die Transkriptmengen wieder an und nahmen mit der massiven Vermehrung und Reifung der Merozoiten I zu. Die Expressionsstudien von EbMIC4 während der ersten Merogonie zeigten ein vergleichbares Bild. Weiterhin wurden Experimente zur Interaktion des Parasiten mit seiner Wirtszelle durchgeführt. Eine Besonderheit bei E. bovis ist in vivo die lange Verweildauer während der ersten Merogonie in Endothelzellen der zentralen Lymphkapillaren des Ileums. Um eine so lange Zeit in einer Zelle zu überleben, erscheint es unumgänglich, dass der Parasit Vorgänge der Wirtszelle gezielt beeinflusst. Um erste Anhaltspunkte für eine mögliche Manipulation der Wirtszelle zu erhalten, wurden die Gesamtproteome von E. bovis-infizierten Wirtszellen mit denen nicht-infizierter Wirtszellen am 14. Tag p. i. miteinander verglichen. Dazu wurde eine zweidimensionale Auftrennung der zu vergleichenden Proteinproben mit anschließender MALDI-TOF-Fingerprinting-Analyse bezüglich hoch- oder runterregulierter Proteine vorgenommen. Allgemein wurden über E. bovis wesentlich mehr Proteine runter- als hochreguliert. Modifiziert wurden vor allem Proteine des Stoffwechsels und der Biosynthese, Strukturproteine, Proteine der Translation und Transkription sowie Proteine der Apoptose. Dabei bestätigten diese Studien frühere Arbeiten, bei denen gezeigt wurde, dass E. bovis die Apoptosefähigkeit der Wirtszelle beeinträchtigt.

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