Phosphotyrosin-Phosphatasen und Zellpopulationen der Leber unter dem Einfluß von Methotrexat
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Zusammenfassung
In der hier vorgelegten Arbeit wurde das Vorkommen spezifischer Phosphotyrosin-Phosphatasen PTP1B bzw. TcellPTP und SHP1 bzw. SHP2 - in der Leber von Rattenuntersucht. Eine genauere Analyse erfolgte für SHP1/PTP1C und SHP2/PTP1D. Zusätzlich wurde das Verhalten der Tyrosinphosphatasen unter dem Einfluß von Methotrexat (MTX) analysiert. Das Erfassen von PTP1B und TcPTP in Leberschnitten mittels Immunfluoreszenztechnik war nicht möglich. Jedoch konnte mittels des sensitiveren SDS-Page das Vorkommen dieser beiden Formen in der Leber bestätigt werden. Die weiteren immunzytochemischen Untersuchungen beschränkten sich auf die SHP1 bzw. SHP2-Form. Diese wurden sowohl mit einem polyklonalen Antikörper, der auf Grund der großen Sequenzhomologie der Enzyme beide Formen gleichzeitig erfaßt, als auch mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt. Es gelang der lichtmikroskopische Nachweis dieser beiden Enzyme in der Leber, wobei ihr Vorkommen auf die Non-Parenchymzellen beschränkt war. Die Identifikation dieser reaktiven Zellen erfolgte über Doppelfärbungen einerseits mit zelltypspezifischem Antikörper und dem Antikörper gegen die Tyrosinphosphatase. So konnte gezeigt werden, daß sowohldie SHP1- als auch die SHP2-Form in den Ito- (spezifischer Antikörper: Desmin, GFAP), Kupffer- (spezifischer Antikörper: ED1, ED2, OX6) und NK- (spezifischer Antikörper: 3.2.3 Antikörper gegen NKR-P1) Zellen vorkommt. Das Vorkommen der SHP1 in den Kupffer- und Ito-Zellen wurde hier zum ersten Mal beschrieben. Die biochemische Analyse erfolgte sowohl am Gesamtleberhomogenat als auch an zwei isolierten Zellpopulationen, nämlich an Endothel- und Kupffer-Zellen, die über das Elutriationsverfahren gewonnen wurden. Die Messung der Gesamtaktivität der PTPs bestätigte in gewisser Weise die morphologischen Beobachtungen. Die Gesamtaktivität der PTPs war an den Kupffer-Zellen ca. 4mal so hoch wie in dem Gesamthomogenat, während die Aktivität der Endothelzellen nur etwa 60% der Aktivität des Leberhomogenats entsprach. Weitere Analysen erfolgten mittels Western-Blotting sowohl im Gesamtleberhomogenat als auch im Homogenat der isolierten Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Lebern nach Methotrexat-Behandlung untersucht. In den Hepatozyten der behandelten Lebern ließ sich weder PTP1b noch TcPTP nachweisen. Für die Non-Parenchymzellen ergab sich das gleiche Muster SHP1 und SHP2 in allen Zellen außer den Endothelzellen wie bei den unbehandelten Tieren. Unter dem Einfluß von MTX kam es zu Veränderungen periportal gelegener Non-Parenchymzellen. Die Populationsanalyse ergab quantitative Veränderungen sowohl bei den Kupffer-, als auch den bei den NK-Zellen. Während die zahl der Kupffer-Zellen signifikant unter der Behandlung mit MTX abnahm, verdoppelte sich die Zahl der NK-Zellen. Dies gilt auch für die NK-Zellen der perivenösen Zone. Für die Ito-Zellen konnte noch zusätzlich deren Aktivierung durch MTX gezeigt werden.
The presented study deals with the occurence of selected proteintyrosine phosphatases PTP1B and TcellPTP, PTP1C and PTP1D - in rat liver. The experiments were mainly focused on one group of these PTPs, namely PTP1C/SHP1 and PTP1D/SHP2. In addition those tyrosine phosphatases were screened in liver from animals submitted to methotrexate treatment. Proteintyrosine phosphatase 1B, as well as the closely related form Tcell PTP could not be detected by immunofluorescence technique. Yet, the more sensitive Western blotting technique revealed the existence of both these forms in rat liver. Further detailed immunofluorescence experiments were restricted to SHP1 and SHP2. These PTPs were traced as well with polyclonal antibody, which detects both forms simultaneously because of the high sequence homology, as with monoclonal antibodies. Both forms were detected in rat liver, yet, there presence was restricted to non-parenchymal cells. These reactive cells were identified by double immunostaining together with a cell type specific second antibody in combination with the specific antibody to PTP. This way, the presence of both forms - SHP1 and SHP2 in Ito cells, Kupffer cells and liver specific Natural-Killer cells was shown. This was the first time to demonstrate the occurrence of SHP1 in Kupffer cells and Ito cells. Biochemical data were retrieved as well from whole liver homogenates and from two isolated cell populations, endothelial cells and Kupffer cells, which were won by the technique of elutriation. Comparison of PTP activity determination of the whole homogenate with the activity of Kupffer cells stressed the morphologic results. The activity of Kupffer cellssurpassed the activity of whole liver by more than 4 times. In contrast the activity of endothelial cells was only 60 % of whole liver activity. Whole liver homogenate and homogenate of isolated cells were analyzed by Western blotting. The second part of the study comprised the experiments performed with livers of methotrexate treated rats. Comparable to control livers neither PTP1B nor Tcell PTP were detected by immunfluorescence techniques. Non-parenchymal cells reacted the same way as observed in control livers: SHP1 and SHP2 were found in all non parenchymal cells, but endothelial cells. MTX treatment resulted in changes in the number of periportal non-parenchymal cells. Kupffer cells were reduced in their number, whereas Natural-Killer cells were doubled not only periportally, but also perivenously. In addition, Ito cells were altered in their activity state.