Untersuchungen der TGF-beta Signaltransduktionskette als möglicher ätiopathogenetischer Faktor der Induratio penis plastica

Abstract

Die Induratio penis plastica (IPP) ist eine Erkrankung der penilen Tunica albuginea mit Bildung eines fibrotischen Plaques. In einem Tiermodell wurde nach subtunicaler Injektion von Cytomodulin eine vermehrte TGF-beta-Expression und IPP-typische histomorphologische Veränderungen nachgewiesen. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die Signaltransduktionskette von TGF-beta-1 als möglicher pathogenetischer Faktor der IPP untersucht. Aus den Plaques von 16 Patienten mit IPP sowie aus der Tunica albuginea von 7 nicht von IPP betroffenen Männern wurde Gewebe entnommen und Zellkulturen angelegt. Als unabhängige Kontrolle wurden kommerzielle dermale Fibroblasten, die aus humaner Vorhaut stammen, mitgeführt. Die Transkriptionsfaktoren Smads wurden auf RNA-, Protein- und Zellebene untersucht. Die Expression von Smad3 und Smad4 war bei der IPP tendenziell stärker als beim Kontrollkollektiv. Dies läßt vermuten, daß TGF-beta-1 einen Einfluß auf die Pathogenese der IPP hat. Auf zellulärer Ebene wurde durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie gezeigt, daß nach Stimulation der Fibroblasten mit TGF-beta-1 nach 15-30 min der Transkriptionsfaktor Smad3 in den Nukleus translozierte. Dieser Vorgang war bei IPP-Fibroblasten ausgeprägter als beim Kontrollkollektiv. Der für die Translokation notwendige Co-Faktor Smad4 wanderte auch 15-30 min nach Stimulation mit TGF-beta-1 in den Zellkern. Hier fand die Translokation im Kontrollkollektiv etwas früher als bei IPP statt. Nach 60 min konnte noch kein wesentlicher Abbau festgestellt werden. Bei den Kontrollen zeichnete sich eine schnellere Translokation in den Nukleus ab. Die Wirkung der Smads wurde durch einen schnelleren Abbau jedoch limitiert. Dies könnte die Entstehung der fibrotischen Plaques bei IPP beeinflussen. Die Fibroblasten-Stimulation mit BMP-2 bewirkt die Aktivierung von Smad1. Die Translokation in den Nukleus wurde nach 15 min, der Abbau und Rücktransport ins Cytosol nach 30 min, nachgewiesen. Bei den Kontrollen zeigte sich eine peri- und nukleäre Anreicherung. Die Stimulation der Fibroblasten mit BMP-2 scheint eine geringere Wirkung zu haben, da die Smads früher als nach TGF-beta-1-Stimulation abgebaut werden. Auf Proteinebene konnten in unseren Westernblot-Versuchen ähnliche Ergebnisse erzielt und die Ergebnisse auf Zellebene bestätigt werden. Nach Zellstimulation mit TGF-beta-1 kommt es nach 15-60 min zur Aktivierung von Smad2/3. Beim Kontrollkollektiv erfolgte die nukleäre Translokation schneller bei früherem Abbau und somit Verkürzung der Wirkung. Eine Stimulation der Fibroblasten mit BMP-2 führte zu keinem Einfluß auf Smad1. Eine Zellstimulation mit TGF-beta-1 und IFN-gamma hat keinen antagonistischen Einfluß auf Smad2/3. Durch die Co-Stimulation steigt in einigen IPP- und Kontroll-Zellinien die Expression von Smad2/3. Diese Ergebnisse wiederlegen eine antifibrotische Wirkung von IFN-gamma, als Antagonist von TGF-beta-1. Auf Proteinebene wurden in unseren Experimenten die Smads bei dermalen, aus der Vorhaut kultivierten Fibroblasten, untersucht. Die Ergebnisse wurden mit denen der tunicalen Fibroblasten verglichen. Da es schwer ist, Biopsien aus der Tunica albuginea von gesunden Personen zu erhalten, werden in der Literatur häufig Zellkulturen aus Vorhaut als Kontrolle angelegt. Unsere Ergebnisse zeigen, daß sich dermale und tunicale Fibroblasten in Bezug auf die TGF-beta-Signaltransduktionskette unterschiedlich verhalten. Studien, in denen als Kontrollkollektiv präputiale Fibroblasten verwendet wurden, müssen kritisch hinterfragt werden. Aufgrund der unterschiedlich schnellen Translokation von Smads nach TGF-beta-Fibroblastenstimulation bei IPP und Kontrollen kann ein Zusammenhang zwischen der IPP und einer Störung in der TGF-beta-Signaltransduktionskette nahegelegt werden. Insbesondere Smad2/3 und die aktivierte Form pSmad2/3 translozieren nach TGF-beta-Stimulation bei IPP-Fibroblasten schneller in den Zellkern und verbleiben dort länger als bei den Kontrollen. Im Nukleus löst der Smad-Komplex die Transkription von Proteinen aus. Die Expression von Smad3 und Smad4 ist aus IPP-Plaque-Fibroblasten isolierter RNA höher als bei Kontroll-RNA. Die Ergebnisse sind auf RNA-, Protein- und Zellebene ähnlich und unterstützen die These, daß eine Störung in der TGF-beta-Signaltransduktionskette für die Entstehung der IPP verantwortlich sein könnte. Weitere Untersuchungen zum genauen Pathomechanismus der IPP sind notwendig. Peyronie´s disease (PD) is an aquired disease of the penile tunica albuginea typified by the development of a fibrotic plaque. Cytomodulin was injected in the tunica albuginea of rats in an animal model. This caused an increased expression of TGF-beta-1 and formation of PD-like plaque with its typical histomorphologic alterations. Based on this results this doctoral thesis has investigated the pathway of TGF-beta-1 as a potential pathogenetic factor of PD. Biopsies were taken from the plaques of 16 patients suffering from PD as well as from tissue from tunica albuginea of 7 patients without PD. Cell culture was initiated from this tissue. Commercial dermal fibroblasts derived from foreskin were cultured as an independent control. The transcriptional factors Smads were investigated on RNA-, protein- and cellular level. The RNA-expression of Smad3 and Smad 4 was increased in patients suffering from PD. After binding of TGF-beta-1 at its receptors Smad3 will be activated. The phosphorylated Smad3 binds a complex with Smad4 and translocates into the nucleus, where the complex initiates transcription. We suppose that TGF-beta-1 has an influence on the pathogenesis of PD. It was shown by immunofluorescence microscopy that Smad3 translocates into the nucleus 15-30 minutes after stimulation with TGF-beta-1 on a cellular level. This effect is stronger and the onset is earlier in plaque-derived fibroblasts from PD than in the control group. The translocation of Smad4 into the nucleus was found after 15-30 minutes. It was earlier in the control group but the retransport into the cytosol was also earlier. The effect of Smad4, together with other activated Smads, was enlongated in the group of PD. This could effect the origin of this disease. Stimulation of fibroblasts with BMP-2 also resulted in increased levels of activated Smad1. Smad1 translocated in the nucleus 15 minutes after stimulation. The retransport into the cytosol was performed after 15 minutes in PD-fibroblasts. In the controls peri- and nuclear enrichment was seen. We suppose that BMP-2 has less effects on the penile fibroblasts compared to TGF-beta-1. The Smads return earlier back to cytosol after BMP-stimulation than after TGF-beta-stimulation. On the protein level the Westernblot analysis were similar to that of RNA and cellular level. The translocation of pSmad2/3 was found 15-60 minutes after stimulation with TGF-beta-1. It was earlier in control group but therefore the retransport started earlier. This limits the effect. Stimulation of the fibroblasts with BMP-2 did not lead to any special effect to Smad1. Stimulation of the fibroblasts with TGF-beta-1 and IFN-gamma did not show any antagonistic effect on Smad2/3. In some of the tested cell lines from PD and controls expression of Smad2/3 was even increased after co-stimulation. This refutes to the known antifibrotic effect of IFN-gamma as an antagonist of TGF-beta. We have compared our results from fibroblasts derived from tunica albuginea and plaque with that of dermal fibroblasts from foreskin. In other cell culture based studies foreskin fibroblasts are used frequently for control of PD. Our investigations have shown that preputial cells differ in the TGF-beta-pathway compared to fibroblasts from tunica albuginea. Consequently, all investigations on PD-fibroblasts compared with foreskin derived fibroblasts should be discussed critically. A connection between PD and alterations of the TGF-beta-pathway can be supposed based on the fact of varying speed of Smad-translocation after stimulation with TGF-beta. Smad2/3 and the activated form pSmad2/3 translocate earlier after TGF-beta stimulation in fibroblasts of PD than in controls. They remain longer in nucleus than controls. In the nucleus the Smad-complex resolves transcription of proteins. RNA-Expression of Smad3 and Smad4 is higher in PD derived fibroblasts in contrast to RNA from controls. The results are similar on a RNA-, protein- and cell-level. These findings support the hypothesis that alterations in the TGF-beta-pathway contribute to the pathogenesis of PD. Further studies will be necessary to inquire into the exact pathogenesis of Peyronie´s disease.