Klonierung und regulierbare Expression des löslichen VEGF-Rezeptors sFlt-1 in vitro

Abstract

Eine vermehrte Freisetzung von VEGF (vascular endothelial growth factor) im Auge führt bei Krankheiten wie der AMD (Altersbedingte Maukuladegeneration) oder der DR (Diabetische Retinopathie) zu unkontrolliertem Gefäßwachstum. Wiederholte Injektionen von anti-angiogenen Molekülen wie Lucentis® (Ranibizumab) oder Avastin® (Bevacizumab) stellen die aktuelle Leitlinientherapie dar. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Gentherapie mit welcher anti-VEGF Moleküle über lange Zeit im Auge produziert werden können. Um dies zu erreichen, wurde die lösliche Form des VEGF-Rezeptors 1 (sFlt1) unter Kontrolle eines Tetrazyclin-induzierbaren TetOn-Promotors in eukaryotischen Zelllinien exprimiert und die biologische Aktivität in zellspezifischen Assays analysiert.Die sFlt1 cDNA wurde aus der Cornea extrahiert und vervielfältigt um anschließend in einen TetOn Expressionsvektor kloniert zu werden. HEK293 Zellen wurden mit diesen Konstrukten transfiziert und die Expression von sFlt1 mithilfe des Tetrazyclin-Derivats Doxycyclin induziert. Der Überstand mit dem Genprodukt wurde 24 Stunden nach der Expression abgenommen. Mit ihm wurden HUVEC Migrations Assays durchgeführt um die biologische Aktivität zu bestimmen und mit der von Lucentis® zu vergleichen.sFlt1 wurde erfolgreich hergestellt und von HEK293 freigesetzt. Dies lies sich im Western Blot zeigen. Im HUVEC Migrationsassay zeigte das induzierte sFlt1 eine Reduktion der Zellmigration von 60%(+/- 3%), das nicht-induzierte sFlt1 eine Reduktion von 18% (+/- 1%). Im Vergleich dazu zeigte Lucentis® (100ng) eine Reduktion von 60% (+/- 2%).Die Expression von sFlt1 kann durch die Anwendung des TetOn-Systems kontrolliert werden. Es produziert ausreichende Mengen an sFlt1 um VEGF im HUVEC Migrationsassay zu inhibieren, vergleichbar mit Lucentis®. Diese Ergebnisse zeigen eine mögliche Gentherapie um VEGF bei Krankheiten wie der DR oder der AMD zu hemmen. Upregulation of VEGF (vascular endothelial growth factor) in the eye leads to uncontrolled retinal vessel growth in diseases like AMD (age related macula degeneration) or DR (diabetic retinopathy). Repeated injections of anti-angiogenic molecules like Lucentis® (Ranibizumab) or Avastin® (Bevacizumab) are the state of the art treatment for these disorders. The aim of this study was to develop a gene addition therapy, with which anti-VEGF molecules are produced over long time periods in the eye. To achieve this, I expressed the soluble isoform of the VEGF receptor 1 (sFlt1) under the control of the Tetracyclin-inducible TetOn-promotor in eukaryotic cell lines and analyzed the biological activity cell dependent assay.The sFlt1 cDNA was amplified from corneal extracts and cloned into a TetOn expression vector. HEK293 cells were transfected with these constructs and the expression of sFlt1 was induced with the Tetracyclin-derivate Doxycyclin. The gene-product containing supernatand was collected after 24 hours of expression. HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) migration assays were performed to determine the biological activity of the expressed molecules compared to Lucentis®.The soluble Flt1 receptor was successfully produced and secreated from HEK293, which was documented on a Western blot. In the HUVEC migration assay, the induced sFlt1 sample showed a reduction of cell migration of 60% (+/-3%) and the non-induced sFlt1 sample a reduction of 18% (+/-1%), compared to Lucentis® (100ng) of 60% (+/-2%).The expression of sFlt1 can be controlled using the TetOn system, which produces sufficient amounts of sFlt1 to inhibit VEGF in the HUVEC migration assay compared to Lucentis®. These results provide the basis for a gene-addition therapy to inhibit VEGF in pathologies like AMD or DR.