Nachweis der Sphingosinkinase Isoformen 1 und 2 bei allergischem Asthma am Brown-Norway-Rattenmodell
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Zusammenfassung
Die Pathogenese allergischen Asthmas ist durch die Infiltration der Atemwege mit Leukozyten unterschiedlicher Spezies gekennzeichnet, welche durch Sekretion einer großen Zahl von Mediatorsubstanzen zu den charakteristischen klinischen und pathologisch-anatomischen Veränderungen führen. Art und Ausmaß dieser Veränderungen hängen unter anderem von Anzahl und Aktivierungszustand der eingewanderten immunkompetenten Zellen ab. Bei der allergischen Reaktion werden unterschiedliche Stadien durchlaufen, welche jeweils durch unterschiedliche Zellbilder charakterisiert sind. In den letzten Jahren wurde auch im Zusammenhang mit allergischem Asthma der Sphingolipidmetabolit Sphingosin-1-Phosphat (S1P), ein Produkt des Zellmembranstoffwechsels, bezüglich seiner Funktion bei der Pathogenese entzündlicher Erkrankungen näher untersucht. Es ist bekannt, dass S1P von vielen unterschiedlichen Zellen, darunter auch immunkompetente Zellen, synthetisiert und zum Teil sezerniert werden kann und sowohl intra- als auch extrazellulär vermittelte Effekte auf unterschiedliche Zellpopulationen ausübt. Darunter sind vor allem die mitosefördernde Wirkung sowie die Regulation der zellulären Calciumkonzentration verschiedener Zellspezies und die Förderung der Migrations- und Chemotaxisprozesse immunkompetenter Zellen bekannt. Anhand von In-vitro-Experimenten konnte bereits die Beteiligung von S1P an der Vermittlung allergischer Prozesse bestätigt werden. Des Weiteren konnten erhöhte S1P-Werte in der BAL-Flüssigkeit menschlicher Asthmatiker nachgewiesen werden. Die Herkunft von S1P bei allergischem Asthma wurde bisher jedoch nicht geklärt. Daher sollte in der vorliegenden Untersuchung am Brown-Norway-Rattenmodell anhand des Nachweises des S1P-generierenden Enzymes Sphingosinkinase auf der Proteinebene mithilfe von Immunhistochemie sowie auf der Ebene der mRNA-Expression unter Einsatz von quantitativer Reverse-Transcription-PCR (qRT-PCR) die Synthese von S1P in der Akutphase allergischen Asthmas überprüft sowie die daran beteiligten Zellspezies identifiziert und quantifiziert werden. Hierbei wurden Ratten mit allergischem Asthma mit gesunden Kontrolltieren verglichen. Nach mehrfacher Sensibilisierung mit Ovalbumin (OVA) wurden die Tiere einer inhalativen Allergenprovokation unterzogen. Zur Erfassung der unterschiedlichen Kompartimente Lungengewebe und Alveolarraum wurden sowohl gespülte als auch ungespülte Lungengewebeproben sowie mithilfe bronchoalveolärer Lavage (BAL) gewonnene Zellen untersucht. Es konnte sowohl auf der Proteinebene als auch auf der Ebene der mRNA-Expression nachgewiesen werden, dass die Allergenprovokation OVA-sensibilisierter Tiere mit einer signifikant gesteigerten Expression des Enzymes SPHK1 24 Stunden später einhergeht. An der SPHK1a-Produktion waren sowohl glatte Muskelzellen der Lungengefäße sowie der Bronchien als auch Neutrophile Granulozyten und Makrophagen beteiligt, wobei der bei den Tieren der Asthmagruppe nachgewiesene transiente Anstieg der SPHK-Expression durch Erhöhung des Anteils SPHK1a-exprimierender immunkompetenter Zellen im Lungengewebe sowie im Alveolarraum verursacht wurde. Diese konnten im Lungengewebe zu ca. 80% als ED1-positive Makrophagen und zu 20% als gp91phox-positive neutrophile Granulozyten identifiziert werden, während in der BAL bei den meisten Tieren alle SPHK1a-immunreaktiven Zellen ED1-positive Makrophagen waren. Bei vereinzelten Tieren beider Gruppen zeigten nur gp91phox-immunreaktive Zellen eine SPHK1a-Immunreaktivität. Die bei Kontrolltieren vorhandenen SPHK1a-immunreaktiven Zellen waren zum größten Teil im perivaskulären und -bronchialen Bereich akkumuliert, während bei den Asthmatieren ein großer Teil der peripher gelegenen immunkompetenten Zellen ebenfalls SPHK1a exprimierten, was möglicherweise durch den migrationsfördernen Effekt von S1P verursacht wird. Der Nachweis größerer Unterschiede zwischen Asthma- und Kontrolltieren bei der Untersuchung ungespülten Lungengewebes im Vergleich mit gespültem Lungengewebe weist auf die Migration eines Teils der S1P-produzierenden Zellen in den bronchoalveolären Raum hin. Die vorliegenden Befunde lassen auf eine Beteiligung von S1P bei der Vermittlung der charakteristischen Veränderungen in der späten Akutphase allergischen Asthmas schließen, wobei S1P vermutlich nicht nur intrazelluläre Effekte ausübt, sondern nach dessen Sekretion benachbarte fixe und mobile Zellen mit beeinflusst. 48 Stunden nach Allergenprovokation war immunhistochemisch ein Rückgang der SPHK1a-Expression durch immunkompetente Zellen in Lungengewebe und BAL festzustellen, was darauf schließen lässt, dass S1P lediglich an der Vermittlung entzündlicher Prozesse in der Akutphase allergischen Asthmas beteiligt ist. Der in der qPCR ermittelte Anstieg der SPHK1 und 2-Expression 48 Stunden nach Allergenprovokation könnte ein Hinweis auf einen zweiten Anstieg der S1P-Produktion zu einem späteren Zeitpunkt sein. Im Gegensatz zu bisherigen Untersuchungen war die relative Expression von SPHK2 in Lungengewebe und BAL stärker als die relative Expression der Isoform SPHK1, was in Ermangelung eines Antikörpers gegen diese Isoform immunhistochemisch nicht überprüft werden konnte. Die Befunde dieser Arbeit bestätigen die bisher vorliegenden Erkenntnisse zur Beteiligung der Mediatorsubstanz S1P bei allergischem Asthma. Der Nachweis der erhöhten Expression von SPHK vorwiegend durch Makrophagen, welche als wichtige Effektorzellen im Rahmen allergischen Asthmas bekannt sind, trägt zum Verständnis der in Makrophagen ablaufenden Signaltansduktionsprozesse in der Frühphase allergischem Asthmas bei. Die Aufklärung der zeitlichen Abläufe der SPHK-Expression unterstützt die Annahme, dass Makrophagen in den verschiedenen Phasen der allergischen Reaktion durch Änderung ihres Cytokinmusters unterschiedliche Funktionen ausüben können. Kenntnisse über die Rolle von S1P und die beteiligten Enzyme und Metaboliten des Sphingplipidstoffwechsels bei allergischem Asthma sind für eine mögliche pharmakologische Beeinflussung notwendig. Diese Möglichkeit wurde bereits anhand des partiellen S1P-Agonisten FTY720 untersucht und könnte in Zukunft einen Ansatzpunkt zur Therapie des allergischen Asthmas darstellen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2007