Charakterisierung des genetischen Defektes der GM1-Gangliosidose beim Alaskan Husky
Lade...
Datum
Autor:innen
Betreuer/Gutachter
Weitere Beteiligte
Beteiligte Institutionen
Herausgeber
Zeitschriftentitel
ISSN der Zeitschrift
Bandtitel
Verlag
Lizenz
Zitierlink
Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des genetischen Defektes der GM1-Gangliosidose beim Alaskan Husky und die Etablierung eines molekularbiologischen Nachweisverfahrens zur frühzeitigen Detektion heterozygoter Anlageträger. Um den genetischen Defekt zu charakterisieren, wurden auf mRNS-Ebene eine PCR mit dscDNS von gesunden Kontrolltieren, heterozygoten Anlageträgern und einem homozygoten kranken Alaskan Husky durchgeführt. Dadurch wurde beim heterozygoten Anlageträger die Anwesenheit zweier mRNS-Populationen nachgewiesen: eine mit dem normalen und eine mit einem abnormalen Exon 15.Um weitere genetische Defekte bzw. deren Auswirkungen zu untersuchen, wurden mehrere kanine saueren beta-Galaktosidase-Primer in der 'nested'-PCR eingesetzt. Unter Verwendung eines Primerpaares, das den ganzen kodierenden Bereich des kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gens amplifiziert, wurde bei gesunden Kontrolltieren eine Bande in der erwarteten Größe von 2022bp beobachtet. Bei heterozygoten Anlageträgern und beim kranken Alaskan Husky konnten 2 Banden mit einem 251bp bzw. 270bp Unterschied beobachtet werden. Mittels Sequenzierung wurde deren Zugehörigkeit zur kaninen sauren beta-Galaktosidase mRNS nachgewiesen. Zur Eingrenzung des genetischen Defektes wurden die erhaltenen PCR-Produkte als Matrize in einer 'nested'-PCR mit kaninen sauren beta-Galaktosidase spezifischen Primerpaaren, die den Bereich zwischen den Positionen 79 1881 amplifizieren, eingesetzt. Die daraus resultierenden PCR-Produkte wurden in Plasmidvektoren eingebaut und anschließend in E. coli transformiert. Durch Sequenzierung der erhaltenen Plasmide wurde festgestellt, dass alle PCR-Produkte den kodierenden Bereich des kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gens enthalten. Es konnte ein Verlust von Exon 15 und die Anwesenheit einer 19 Basenpaaren langen Duplikation auf dem Exon 15 zwischen den Positionen 1688-1689 bei heterozygoten Anlageträgern und dem homozygot kranken Alaskan Husky detektiert werden. Da Mutationen auf dem Exon 15 des sauren ß-Galaktosidase-Gens, welche die GM1-Gangliosidose bei Hund und Mensch hervorrufen, bekannt sind, wurde eine PCR bei gesunden, heterozygoten Anlageträgern und dem homozygot kranken Hund mit einem Primerpaar durchgeführt, das einen Abschnitt des Exon 15 zwischen den Positionen 1528-1710 amplifiziert. Dadurch wurde auf DNS-Ebene die Anwesenheit eines 'Wildtyp' Exon 15 bei gesunden, eines abnormalen Exon 15 bei kranken und beider Exons bei heterozygoten Tieren nachgewiesen. Durch die gefundene 19 bp Duplikation in dem kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gen kommt es bei heterozygoten Anlageträgern und dem homozygoten Alaskan Husky zu einer Leserasterverschiebung ('frame shift'). Hierdurch entsteht ein frühzeitiges Stoppkodon, das zur Translation eines abnormalen, 67 Aminosäuren kürzeren, Polypeptids führt, welches im Carboxy-Terminalen Bereich keine Homologie zur kaninen sauren beta-Galaktosidase aufweist. Die 19bp Duplikation enthält mehrere Cytosin-Wiederholungen. Dieses Cytosin/Adenin-Muster ( .CCCA....CCCCA .) bildet zusammen mit den 5 - und 3 - benachbarten Nukleotidsequenzen einen 'exonic splicing silencer', welcher das alternative Spleißen bevorzugt, ohne die vollständige Abschaffung des konstitutiven Spleißens. Das alternative Spleißen verursacht den Verlust von Exon 15, bis auf 5 Nukleotide (5 -GGAAG-3 ), welche die normalen Spleißstellen enthalten. Dieses Nukleotidfragment verursacht eine Leserasterverschiebung und die Entstehung eines frühzeitiges Stoppkodons, das auf dem letzten Exon des kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gens lokalisiert ist. Nach der Translation der falsch gespleißten mRNS entsteht ein 151 Aminosäure-verkürztes Polypeptid ohne Homologie mit der kaninen sauren beta-Galaktosidase mRNS im Carboxy-Terminalen Bereich. In der vorliegenden Studie gelang zum erstenmal in der Veterinär- und Humanmedizin die Identifikation und Charakterisierung einer genetischen Modifikation als Ursache für die GM1-Gangliosidose, die direkt eine Leserasterverschiebung bewirkt, aber auch indirekt durch Beeinflussung des mRNS-Spleißens als 'exon skipping enhancer' Element agiert. Da die GM1-Gangliosidose beim Alaskan Husky klinisch, biochemisch und pathologisch (Müller et al., 1998, 2001) diagnostiziert wurde, ist die Hypothese aufzustellen, dass die Leserasterverschiebung und der frühzeitige Abbruch der Translation die Ausfallserscheinungen verursachen. Bei heterozygoten Anlageträgern hingegen wurde eine Reduzierung der sauren beta-Galaktosidase-Aktivität im Vergleich zu gesunden Tieren festgestellt, was auf die verminderte Menge an Wildtyp mRNS-Molekülen ('gene dosis' Effekt) zurückzuführen ist.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2005