Analyse der 3` nicht translatierten Region von BVDV CP7

Abstract

Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung von Sequenz- und Strukturelementen innerhalb der 3 nicht translatierten Region (NTR) von BVDV zu untersuchen. Hierzu wurden Deletionsmutanten im Kontext eines kompletten Virusgenoms hergestellt und ihre phänotypischen Eigenschaften in vitro charakterisiert. Die 3NTR von BVDV Stamm CP7 umfasst 188 Nukleotide. Durch Computervorhersagen und biochemische Analysen konnte gezeigt werden, dass sich die 3NTR von CP7 zu 3 Stemloops (SL) faltet, welche durch einzelsträngige Regionen (ssr) getrennt werden. In der Analyse wurden die verschiedenen RNA-Sequenz- und RNA-Sekundärstrukturelemente der 3NTR mittels 15 4-Basen-Deletionen sowie der Deletion kompletter SL hinsichtlich ihrer Bedeutung für die virale Replikation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 3 terminale Stemloopstruktur SL I ein essentielles Element für die pestivirale Replikation darstellt. Alle diesen SL betreffenden 4-Basen-Deletionen sowie eine Mutante, bei der der komplette SL I deletiert worden war, führten mit Ausnahme der Mutante M3, von welcher replikationskompetente Pseudorevertanten mit deutlich eingeschränkter Replikationskapazität isoliert werden konnten, zu einem vollständigen Verlust der Replikationsfähigkeit. Mittels 4-Basen-Deletionen war es möglich zu ermitteln, dass der 3 teminale Teil der ssr, welche SL I und SL II trennt, ebenfalls essentiell für die Replikation ist, wohingegen Deletionen im 5 terminalen Teil der ssr zu keinem Verlust der Replikationsfähigkeit führten. Alle eingeführten 4-Basen-Deletionen in SL II, SL III und der ssr, die SLII und SLIII trennt, resultierten in infektiösen Viren, welche sich phänotypisch nicht wesentlich vom parentalen Virus unterschieden. Auch die Deletion von SL III resultierte in einem Virus, das keine Unterschiede zum parentalen Virus CP7-388 aufwies. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu den Studien im Replikon-System, in denen essentielle Sequenz- und Strukturmotive im SL III postuliert wurden. Die Deletion von SL II führte zum Auftreten von Pseudorevertanten, welche immer noch eine 58 nt lange Deletion beinhalten, bemerkenswerterweise aber zu hohen viralen Titern in Zellkultur wachsen. Eine Deletion von sowohl SL II als auch SL III resultierte in einem Verlust der Replikationsfähigkeit. Ob dies für Sequenzbereiche mit ähnlicher Funktion innerhalb von SL II und SL III spricht, oder rein sterische Gründe hat, mit der dieser Teil der 3NTR die Replikationsinitiation am 3 Terminus ermöglicht, bleibt durch weiterführende Experimente zu klären. The aim of this study was to evaluate the importance of sequence and structural elements within the 3 nontranslated region (3NTR) of BVDV. To pursue this approach, deletion mutants were constructed in the context of a infectious full-length viral genome, and their phenotypic properties were characterised in vitro. The 3NTR of BVDV strain CP7 comprises 188 nucleotides. According to computer predictions and biochemical analyses the 3NTR folds into three stable stemloop (SL) structures, which are separated by two short single-stranded regions (ssr). In the analysis regarding the 3NTR of CP7 the different sequence and structural elements were examined concerning their importance for viral replication by introduction of 15 4-base deletion mutants and by deletion of complete stemloops. It was shown that the 3 terminal SL I contains essential elements for pestiviral replication. With the exception of mutant M3, from which replication competent pseudorevertants with severely restricted capability of replication could be isolated, all 4-base deletions introduced into SL I and also the deletion of SL I led to a loss of the ability of replication. By means of 4-base deletions it was also possible to show that the 3 terminal part of the ssr separating SL I and SL II is essential for viral replication, whereas deletions introduced into the 5 terminal part of the ssr did not lead to loss of viral replication. All 4-base deletions introduced into SL II, SL III, and the ssr separating SL II and SL III resulted in the recovery of infectious viruses, which did not show significant phenotypical differences compared to the parental virus CP7-388. The deletion of SL III also resulted in an efficiently replicating virus that displayed no significant differences compared to the parental virus. This is in contrast to published results obtained in the replicon system, which have implicated essential sequence and/or structural motives for viral replication within SL III. The deletion of SL II resulted in the emergence of pseudorevertants still carrying a 58 nt deletion, which were nevertheless still capable to produce high viral titers in tissue culture. A deletion spanning from SL II to SL III resulted in a complete loss of viral replication. Whether this is due to sequence motives with similar function within SL II and SL III or to solely sterical reasons, by which the initiation of replication at the 3 V region of the 3 NTR is facilitated, remains to be investigated.