Identifikation und Untersuchung von guideRNA/Cas9-Konstrukten für CRISPR/Cas9 vermittelte Doppelstrangbrüche im USH2A-Gen

In Europa sind etwa 200.000 Menschen von erblichen Netzhauterkrankungen betroffen, wobei das Usher-Syndrom eine der häufigsten ist. Es wird durch Mutationen im USH2A-Gen verursacht und äußert sich als Kombination aus Retinitis pigmentosa und progredientem Hörverlust. Bislang gibt es keine etablierte kausale Therapie, doch es wird intensiv an gentherapeutischen Ansätzen geforscht. Der vielversprechende AAV-Ansatz ist derzeit jedoch keine Option für größere Gene wie USH2A, da die Vektor-Kapazität begrenzt ist. Zur Entwicklung einer alternativen therapeutische Strategie für das Usher-Syndrom, entwarfen und untersuchten wir vier spezifische guideRNA/Cas9-Konstrukte sowie die dazugehörigen Zielsequenzen für CRISPR/Cas9-induzierte Doppelstrang-brüche im USH2A-Gen. Konstrukt 1 zielt auf Exon 60, Konstrukt 2 auf Exon 61, Konstrukt 3 auf Exon 67 und Konstrukt 4 auf Exon 71 ab.
Wir untersuchten die Effizienz dieser gRNA/Cas9-Kostrukte mit drei Methoden. Im T7-Endonuklease-I-Assay identifiziert und verdaut die T7-Endonuklease fehlgepaarte DNA, die nach einem Doppelstrangbruch entsteht. Ein erfolgreicher Bruch zeigt sich in der Gelelektrophorese durch drei Banden. Für gRNA/Cas9-Konstrukt 1 und 2 konnte eine erfolgreiche Verdauung nachgewiesen werden, während die Analyse für gRNA/Cas9-Konstrukt 3 und 4 uneindeutig blieb.
Im Anschluss führten wir eine TIDE-Analyse durch, mit der Indels identifiziert und quantifiziert werden können, die häufig nach einem DNA-Doppelstrangbruch entstehen. Diese Methode ermöglicht es, die Effizienz der gRNA/Cas9-Konstrukte zu berechnen. Die Ergebnisse zeigten eine Effizienz von 11,4 % für Konstrukt 1, 21,1 % für Konstrukt 2, 5,9 % für Konstrukt 3 und 16,3 % für Konstrukt 4.
Zusätzlich wurde ein BRET-Assay durchgeführt, das einen hochsignifikanten Unterschied in der Fluoreszenzprotein-Emission zwischen den Proben und den Kontrollen zeigte. Die Frameshift-Raten der gRNA/Cas9-Konstrukte lagen bei 31,5 %, 63,0 %, 15,3% und 33,7 %.
Vergleicht man die Ergebnisse der TIDE-Analyse mit denen des BRET-Assays, zeigt sich ein übereinstimmendes relatives Aktivitätsniveau der Konstrukte, wobei gRNA/Cas9-Konstrukt 2 in beiden Untersuchungen die höchste Aktivität aufwies. Mit den von uns entwickelten, effizienten gRNA/Cas9-Konstrukten könnte durch CRISPR/Cas9 ein Austausch defekter DNA-Sequenzen ermöglicht werden, was eine potenzielle Behandlung für das Usher-Syndrom darstellen könnte. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz auch eine vielversprechende Therapie für andere genetische Erkrankungen bieten.