Entwicklung eines PCR basierten Analyseverfahrens zur Bestimmung des Befalls durch Oculimacula spp. sowie Verifizierung von Markern für das Resistenzgen Pch1im Weizen (Triticum aestivum L.)

Abstract

Aufgrund der weltweit großen Verbreitung des hexaploiden Brot- oder Weichweizens (Triticum aestivum L. em. Thell.) und enger Fruchtfolgen sind Pilzkrankheiten bei Weizen von besonderer Bedeutung. Der parasitäre Halmbruch stellt in der gemäßigten Klimazone eine wichtige Krankheit dar und kann erhebliche Ertragsverluste verursachen. Wesentliche Erreger der Krankheit sind die Pilzpathogene 0culimacula acuformis (syn. Tapesia acuformis; anamorph: Helgardia acuformis syn. Pseudocercosporella herpotrichoides var. acuformis) und 0. yallundae (syn. T. yallundae; anamorph: H. yallundae syn. P. h. var. herpotrichoides). Gegen diese Ascomyceten, die gleiche Symptome hervorrufen und visuell nur mikroskopisch unterschieden werden können, bewirkt das Resistenzgen Pchl aus Aegilops ventricosa die bisher effektivste Resistenz. Zusätzlich wird im deutschen Winterweizenmaterial Pch2 genutzt, welches in der Winterweizensorte "Cappelle Desprez" identifiziert wurde. Andere Resistenzgene, z.B. aus Dasypyrum villosum, Ae. tauschii, T. monococcum, T. durum, Ae. kotschyi, Thinopyrum ponticum und Th. intermedium, werden bisher in der praktischen Pflanzenzüchtung nicht genutzt.Zur Unterscheidung von 0. acuformis und 0. yallundae Infektionen nach künstlicher Inokulation im Gewächshaus und zur quantitativen Differenzierung der Anfälligkeit von Weizengenotypen wurden in dieser Arbeit zwei SYBR Green® basierte Real-time PCR Assays entwickelt. Der Einfluss von Inkubationszeit zwischen Inokulation und Probenahme, der Pathogeneffekt (0. acuformis und 0. yallundae) sowie der Einfluss von Resistenzgenen (Pchl, Pch2, anfällig) auf den Pathogen-DNA-Gehalt im Weizenmaterial wurde ermittelt. Es wurde festgestellt, dass 12 Wochen nach Inokulation mit 0. yallundae die eindeutigste Differenzierung von Genotypen mit unterschiedlichem Resistenzniveau nachweisbar war. Genotypen, welche das Resistenzgen Pchl tragen, zeigten signifikant geringere Pathogen- DNA-Gehalte als der Pch2-Träger "Cappelle Desprez" und anfällige Linien. Diese Phänotypisierungsmethode ermöglicht mithin eine klare Differenzierung und kann somit als Grundlage für die Entwicklung von eng gekoppelten Markern für Halmbruchresistenzgene genutzt werden.Die Verfügbarkeit eng gekoppelter Marker in markergestützten Selektionsverfahren ist abhängig von deren diagnostischem Wert. Um die Nutzbarkeit von eng mit Pchl gekoppelten Markern zu ermitteln, wurden drei Kreuzungsnachkommenschaften (DH-Populationen) per isoelektrischer Fokussierung auf das Vorhandensein der mit Pchl gekoppelten Endopeptidase Ep-Dla analysiert. Basierend auf 127 DH-Linien und 27 Markern wurde eine genetische Karte von Chromosom 7D erstellt. Die Marker Xorwl, Xorw5, Xorw6, Xcfdl75, Xbarc76, Xwmcl4 und Xcfa2040 zeigten eine vollständige Kopplung mit Ep-Dla. Die Marker Xorwl, Xorw6, Xcfdl75, Xbarc76 und Xwmcl4 wurden daraufhin anhand eines Sets von 104 Winterweizensorten evaluiert und mit Ergebnissen der vom Bundessortenamt durchgeführten Resistenztests für Halmbruchanfälligkeit verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Marker Xorwl, Xorw6 und Xcfdl75 für den Einsatz in der markergetützten Selektion auf Pchl momentan am besten geeignet scheinen.Bedingt durch die rasante Entwicklung in Sequenzierungs- und Markertechniken ist davon auszugehen, dass die markergestützte Selektion zukünftig noch deutlich an Bedeutung gewinnen wird - insbesondere in der Züchtung auf komplexe quantitative Merkmale. Bread wheat (Triticum aestivum L. em. Thell.) is one of the most important crop species worldwide. Due to this fact and reduced crop rotations many fungal diseases are common in wheat. Eyespot is one important disease of wheat in temperate climates and can cause severe yield losses. Causal agents of eyespot are the ascomycetes 0culimacula acuformis (syn. Tapesia acuformis; anamorph: Helgardia acuformis syn. Pseudocercosporella herpotrichoides var. acuformis) and 0. yallundae (syn. T. yallundae; anamorph: H. yallundae syn. P. h. var. herpotrichoides). The two pathogens generate similar symptoms and can only be distinguished visually by microscopic analyses. Pchl, which derived from Aegilops ventricosa and is located on chromosome 7DL, is the most important and most effective resistance gene against eyespot. Additionally, Pch2 derived from the winter wheat cultivar "Cappelle Desprez" is used in wheat breeding and present in several German cultivars. Resistance genes, which were additionally detected in different species like Dasypyrum villosum, Ae. tauschii, T. monococcum, T. durum, Ae. kotschyi, Thinopyrum ponticum and Th. intermedium, are not applied in practical wheat breeding, yet.In order to distinguish between 0. acuformis and 0. yallundae infections and furthermore to reliably identify quantitative differences in the level of resistance of wheat genotypes, two SYBR Green® based Real-time PCR assays were developed in the course of this work. The influence of time after inoculation until sample collection, the effect of pathogen species (0. acuformis, 0. yallundae), and the relevance of resistance genes (Pchl, Pch2, susceptible allele) on the pathogen-DNA content in wheat cultivars were analysed. The most clear-cut difference between resistant and susceptible wheat genotypes was obtained 12 weeks after inoculation with 0. yallundae. Genotypes carrying Pchl showed significantly less pathogen DNA content than the Pch2-carrier "Cappelle Desprez" and susceptible lines. Growth chamber tests using artificial inoculation with 0. yallundae and sampling 12 weeks after inoculation for Real-time PCR are shown to be a reliable procedure to determine the differences of resistance level in wheat against eyespot. This protocol can be used as a basis for the development of efficient molecular markers linked to eyespot resistance genes.Marker assisted selection by closely linked markers is only suitable if these markers are also diagnostic. Therefore, based on results obtained for endopeptidase Ep-Dla, which is very closely linked to Pchl, molecular markers located in the terminal region of chromosome 7DL were analysed in three doubled haploid (OH) populations. Based on the analysis of 127 OH lines with 27 markers, linkage to Pch1 (Ep-01) was obtained for Xorw1, Xorw5, Xorw6, Xcfd175, Xbarc76, Xwmc14, and Xcfa2040. By analyses of 104 German winter wheat cultivars the markers Xorw1, Xorw6, Xcfd175, Xbarc76 and Xwmc14 were validated for their diagnostic character in order to obtain information on their usefulness for marker assisted selection (MAS). For this purpose they were compared to the results obtained with Ep-01 and the classification for the reaction to eyespot by the German Plant Variety Office (Bundessortenamt). Analyses of German winter wheat cultivars showed that out of these markers, Xorw1, Xorw6 and the SSR Xcfd175 are well suited for MAS in wheat breeding.Oue to the fast development in sequencing and marker techniques it is assumed that marker assisted selection will become even more important in near future - particularly in breeding for complex quantitative traits.