Non-invasive, pränatale Bestimmung fetaler Blutgruppenmerkmale an Thrombozyten (HPA-Merkmale) aus mütterlichem Plasma mittels Next-Generation-Sequencing (NGS)

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2019

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-14887

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Hintergrund: Die fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie (FNAIT) beruht auf einer fetomaternalen Inkompatibilität der humanen Plättchenantigene (HPA-Merkmale). Die Mutter bildet thrombozytäre Alloantikörper gegen fetale, vom Vater vererbte Antigene, welche, nach Transport über die Plazenta in die fetale Zirkulation, eine fetale/neonatale Thrombozytopenie auslösen können. Die schwerwiegendste Komplikation stellt die intrakranielle Blutung des Fetus dar. Eine Genotypisierung der fetalen HPA-Merkmale ist notwendig, wenn der Vater für das implizierte Merkmal heterozygot ist, um festzustellen, ob der Fetus das Risikoallel trägt und ob prophylaktische, pränatale Interventionen, wie die maternale Gabe von i.v. Immunglobulin, erforderlich sind. Die bisher beschriebenen Verfahren zur pränatalen, nicht-invasiven Genotypisierung fetaler humaner Plättchenantigene verzichten auf eine interne Kontrolle für das Vorhandensein fetaler DNA in der Plasmaprobe. Patientinnen/Proband/-innen und Methoden: Zunächst erfolgte eine Validierung der nicht-invasiven, fetalen RHD-Bestimmung aus zellfreiem, maternalem Plasma mittels Real-time-PCR. Hierzu wurden Blutproben von 23 gesunden, nicht-schwangeren Blutspender/-innen sowie von 29 RhD-negativen Schwangeren, welche bei der Blutentnahme kurz vor einer elektiven Sectio Caesarea standen, untersucht. Zur Etablierung des nicht-invasiven Nachweises fetaler HPA-Merkmale mittels massiv-paralleler Sequenzierung (Next-Generation-Sequencing) wurde von 13 Schwangeren (5 Fälle mit vorbekannter FNAIT) und 3 gesunden, nicht-schwangeren Blutspender/-innen zellfreie DNA aus dem Plasma isoliert. Die Blutentnahme der Schwangeren erfolgte im Median in der 30. Schwangerschaftswoche (Spannweite: 14. - 41. SSW). Mit Gen-spezifischen Primerpaaren wurden die Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) ITGB3 (HPA-1), ITGA2B (HPA-3), ITGA2 (HPA-5), sowie CD109 (HPA-15) gezielt amplifiziert und mittels Next-Generation-Sequencing (Halbleitertechnologie) sequenziert. Als interne Positivkontrolle sowie zur Bestimmung der fetalen DNA-Fraktion dienten folgende SNPs bzw. Exonsequenzen: RHD, RHCE, KEL, DARC, SLC14A1, GYPA, GYPB, SLC4A1, Y-chromosomale Sequenzen sowie 8 (Primer Panel I (PP I)) bzw. 14 (Primer Panel II (PP II)) autosomale, anonyme Polymorphismen. Ergebnisse: Real-time-PCR: Alle RhD-positiven Feten (n=15) wurden erfolgreich detektiert. Bei den Plasmaproben von Schwangeren mit bestätigten RhD-negativen Feten (n=10) wurde in 7 von 10 Fällen das Nichtvorliegen einer fetomaternalen RhD-Inkompatibilität richtig erkannt. In den anderen drei Fällen war das Ergebnis nach vorab definierten Kriterien indeterminiert. Vier Plasmaproben wurden aufgrund einer Verunreinigung exkludiert. Next-Generation-Sequencing: 15 von 19 vorliegenden fetomaternalen HPA-Inkompatibilitäten wurden erfolgreich detektiert, bei den anderen vier Fällen lag der Anteil paternaler, fetaler Allele unter dem vorab definiertem Schwellenwert von 2 %. Bei dem Nichtvorliegen einer fetomaternalen HPA-Inkompatibilität (n=33) erfolgte in allen Fällen, bis auf eine Ausnahme, richtig negativ keine Detektion des antithetischen Allels. Weitere non-maternale Sequenzen (neben den HPA-Merkmalen), welche als interne Kontrolle für das Vorhandensein fetaler DNA dienten, konnten bei Plasmaproben von 12 Schwangeren nachgewiesen werden. Die Gesamtanzahl der detektierten Reads betrug pro Zielregion im Durchschnitt 5624 (Mittelwert; SD: 3090, Spannweite: 585 - 14453, n=153; PP I), bzw. 2720 (Mittelwert; SD: 1842, Spannweite: 321 - 11666, n=325; PP II). Fetale DNA wurde im Median an 3 Loci (Spannweite: 1 - 8; PP I; 6 Schwangere) bzw. an 7,5 Loci (Spannweite: 1 - 10; PP II, 12 Schwangere) detektiert. Die durchschnittliche Konzentration der fraktionalen, fetalen DNA in maternalem Plasma betrug 8,00 % (Mittelwert; Spannweite: 4,49 % - 15,90 %; PP I), bzw. 13,65 % (Mittelwert; Spannweite: 4,35 % - 29,87 %; PP II). Diskussion: Die gezielte massiv-parallele Sequenzierung ist ein valides Verfahren zur nicht-invasiven, pränatalen Genotypisierung fetaler humaner Plättchenantigene aus maternalem, zellfreiem Plasma. Falsch negative Testergebnisse werden durch die Sequenzierung weiterer Polymorphismen sowie durch die Bestimmung der fetalen, fraktionalen DNA-Konzentration verhindert. Durch die Etablierung der neuen Methode wurde die Möglichkeit geschaffen, auch andere fetale Blutgruppenmerkmale, welche Zielstruktur maternaler Antikörper bei der hämolytischen Erkrankung des Fetus und Neugeborenen sind, pränatal und nicht-invasiv zu bestimmen.

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