Charakterisierung des Core-Proteins von Pestiviren
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Zusammenfassung
Die subzelluläre Lokalisierung und die RNS bindende Aktivität des Core-Proteins von Pestiviren wurden untersucht und folgende Ergebnisse erzielt: 1.- Das Gen des Core-Proteins von KSPV und BVDV wurde in einen prokaryotischen Expressionsvektor kloniert, das Core-Protein in Bakterien (E. coli) exprimiert und durch Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) in hohem Maß gereinigt. Dieses Protein fand Anwendung als Antigen zur Herstellung von mAks und stellte die Basis eines RNS-Bindungsassays dar. 2.- Ein System zum Screening von Hybridom Überständen wurde entwickelt, mit dem acht anti Core-Protein mAk produzierende Hybridome isoliert wurden. Die Anwendung der hergestellten mAks ermöglichte die Detektion des Core-Proteins von 13 Pestiviren verschiedener Spezies [BVDV-1 (7 Stämme); BVDV-2 (2 Stämme); BDV (2 Stämme); KSPV; Giraffe] in infizierten Zellen und aufkonzentrierten Virionen. 3.- Ein Disulfid verbrücktes Core-Protein Homodimer wurde in Virionen von BVDV-2 Stämmen identifiziert und mittels reverser Genetik charakterisiert. Wie bei den Flaviviren kommt das Core-Protein in Virionen von Pestiviren sehr wahrscheinlich als Dimer vor. 4.- In infizierten Zellen kolokalisierte das Core-Protein mit dem endoplasmatischen Retikulum und mit den Mitochondrien. Auch wurde dieses Protein in Assoziation mit den RNA-processing bodies ( P-Bodies ) nachgewiesen, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der Translation spielen. Eine Kolokalisierung des Core-Proteins mit Komponenten der pestiviralen Replikase, nämlich NS3 und NS5B, wurde festgestellt. Das NS5B (virale RNS-abhängige RNS-Polymerase) wurde, wie die drei Strukturproteine Erns, E1 und E2, überwiegend ER assoziiert nachgewiesen. Aufgrund seiner Verteilung könnte das Core-Protein in der infizierten Zelle Prozesse wie z.B. Translation beeinflussen. Die Lokalisierung der Nichtstruktur- bzw. Strukturproteine deutet darauf hin, dass assembly und Replikation bei Pestiviren in demselben Kompartiment stattfinden. 5.- Ein Agarose RNS-Bindungsassay wurde zur Untersuchung der RNS-Bindungsaktivität des Core-Proteins entwickelt. Das Core-Protein band RNS sequenzunabhängig und somit kann die Inkorporation genomischer RNS in die pestiviralen Virionen aufgrund einer spezifischen RNS bindenden Aktivität des Core-Proteins ausgeschlossen werden. Sehr wahrscheinlich wird es durch das zeitlich koordinierte Erfolgen der Replikation des viralen Genoms und des Virus assembly ermöglicht.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2007