Untersuchungen zur Lokalisation und Funktion von Voltage-dependent Anion Channel (VDAC) 1, 2 und 3 in bovinen Spermatozoen

Abstract

VDAC (voltage-dependent anion channel) ist ein kleines, Poren-formendes Protein, welchessynonym als Porin bezeichnet wird. Es kommt sowohl in Bakterien, als auch in der äußerenmitochondrialen Membran sowie in der Plasmamembran somatischer Zellen vor. Die Ziele dieser Arbeit waren 1.) Reinigung spezifischer anti-VDAC Antikörper und derenCharakterisierung bezüglich ihrer Affinität und ihrer Isoform-Spezifität, 2.) Lokalisation vonVDAC1, 2, und 3 in bovinen ejakulierten Spermatozoen und 3.) Untersuchungen zurfunktionellen Bedeutung von VDAC für die Spermatozoenmotilität und bezüglich desakrosomalen Status mit Hilfe der anti-VDAC Antikörper. Die Spezifität der Antikörper wurde durch Immunoblots mit rekombinantem VDAC1, 2 und 3überprüft. Soweit bekannt, sind mit dieser Arbeit die ersten mono-spezifischen AK gegen alledrei VDAC Isoformen charakterisiert worden. Die immunzytochemischen Untersuchungen zeigten, dass VDAC1 im akrosomalen Bereichund in der fibrösen Hülle des Flagellum-Hauptstücks lokalisiert werden konnte. VDAC2wurde im Flagellum und VDAC3 in den Mantelfasern (ODF = outer dense fibers) detektiert.Die Präsenz von VDAC2 und 3 in den ODF konnte mit Hilfe des Immunoblots bestätigtwerden. Alle drei VDAC Isoformen konnten somit in bovinen Spermatozoen lokalisiertwerden und zwar wie beschrieben in unterschiedlichen Kompartimenten. Der Nachweis vonVDAC2 und 3 in den ODF ist zugleich der erstmalige Nachweis von VDAC in einer nichtmembranären Struktur. Dies lässt die Hypothese zu, dass es sich bei VDAC nicht nur um einKanal bildendes Protein handeln könnte und es in ODF eine andere Funktion als inMitochondrien oder Plasmamembranen haben könnte. Die Analyse der Spermatozoenmotilität zeigte nach Inkubation mit anti-VDAC2 Antikörpereine statistisch signifikante Abnahme der Gesamtmotilität. Für diesen Effekt konnte eineDosis-Wirkungs-Abhängigkeit gezeigt werden. Weiterhin riefen alle drei anti-VDAC Antikörper unterschiedlich stark ausgeprägtemorphologische Veränderungen im akrosomalen Bereich des Kopfes hervor: Nach 4hInkubation zeigte sich ein höherer Verlust an intakten Akrosomen im Vergleich zur Kontrolle.VDAC scheint somit wichtig für die Spermatozoenmotilität und die morphologische Integritätdes Akrosoms zu sein. In der Rasterelektronenmikroskopie konnten die durch anti-VDAC Antikörper hervorgerufeneVeränderungen der Spermatozoenköpfe in Form von Membranablösungen und einer Bläschenbildung im Bereich des Akrosoms bestätigt werden. Die distalen Anteile desFlagellums waren häufig eingerollt. Dies sind Hinweise darauf, dass VDAC in dieVolumenregulation von Spermatozoen involviert sein könnte. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die die physiologische Bedeutung von VDAC inSpermatozoen näher zu definieren. VDACs (voltage-dependent anion channels) or porins are small pore-forming proteins firstidentified in outer mitochondrial membranes. VDAC was also found in bacterial membranesas well as in the plasma membrane of somatic cells. The aims of this study were 1) to purify and subsequently characterise specific anti-VDACantibodies, 2) to localise VDAC1, 2 and 3 in ejaculated bovine spermatozoa and 3) todetermine the effect of anti-VDAC antibodies upon bovine sperm function, e.g. motility andacrosomal status. The specificity of the antibodies was demonstrated by immunoblotting using recombinantVDAC1, 2 and 3. The results obtained in this thesis revealed that monospecific antibodies forall three VDAC isoforms were generated. Immunofluorescence microscopy suggests thatVDAC1 protein is present in the sperm acrosome and in the fibrous sheath of the flagellum.The data showed that anti-VDAC2 and anti-VDAC3 antibodies bound to the sperm flagellum,in particular to the ODF (= outer dense fibers). The presence of VDAC2 and 3 in ODF wasstrengthened by immunoblotting results. All three VDAC isoforms could be identified inbovine spermatozoa and were located in different sperm compartments. Extra membranouslocalisation of VDAC2 and 3 in the ODF of the sperm flagellum could be demonstrated forthe first time. We propose that VDAC might have different physiological functions in ODFthan in mitochondria or cell plasmamembranes. Sperm motion analysis after incubation with anti-VDAC2 antibodies yielded a decrease ofsperm motility. A dose-dependency could be demonstrated for this effect.After incubation of spermatozoa with anti-VDAC antibodies it could be observed thatantibodies against all three VDAC isoformes caused morphological alterations at theacrosome that finally led to an acrosomal loss. These morphological changes of the acrosome observed in light microscopy studies could beconfirmed by scanning electron microscopical studies. Furthermore, morphological alterationsof the sperm tail were apparent. Pig tail -like structures at the tip of the flagellum, commonlyseen when spermatozoa are subjected to hypoosmotic conditions, suggest that VADAC mightbe involved in sperm volume regulation. It can be concludeed that VDAC Isoformes in bovine spermatozoa are involved in regulationof different sperm functions, e.g. the maintenance of acrosomal integrity and possibly insperm volume regulation. However, the potential functional roles of VDACs in spermatozoaneed to be evaluated further and will be subject of future scientific investigations.