Nachweis der Expression und Funktionalität des ABC-Transporters P-Glycoprotein in der Bovine Caruncular Epithelial Cell Line 1(BCEC-1)
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Zusammenfassung
Dem ABC-Transporter P-Glycoprotein (P-gp), dem Protein des mdr1-Gens, werdenin Mensch, Ratte und Maus fetus-protektive Aufgaben zugesprochen. Er dient einergroßen Reihe an sehr unterschiedlichen Substraten als Transportsystem. Darunterbefinden sich auch zahlreiche veterinärmedizinische Arzneimittel. Seine Rolle ineiner Zelllinie boviner Karunkel-Epithel-Zellen (BCEC-1) sollte in dieser Arbeit imHinblick auf eine Nutzung als in vitro Modell für plazentaren Transport geprüftwerden.RT-PCR-Analysen bewiesen das Vorkommen der mRNA nicht nur dieses Proteins,sondern auch zweier weiterer ABC-Transporter (BCRP und MRP1) in BCEC-1.Zudem konnten alle drei Vertreter in Karunkel- und Kotyledonen-Gewebenachgewiesen werden.Mit Hilfe immunhistochemischer Untersuchungen wurde P-gp der apikalenZellmembran, das heißt der materno-fetalen Kontaktfläche zugeordnet.Die funktionelle Aktivität des Proteins in der Zelllinie konnte mittels FACS-Analysevisualisiert werden. Hierzu wurde der Efflux des P-gp-Substrates Rhodamin123 mitund ohne Einsatz von P-gp-Inhibitoren Verapamil und PSC833 untersucht.Verschiedene Verapamil-Konzentrationen (200 µM, 50 µM, 12,5 µM, 3,125 µM, 0,78µM) erzeugten zum Teil unterschiedlich starke Inhibitionen. So wurden im Mittel mit3,125 µM Verapamil nur noch 55% der Zellen blockiert. Alle höherenKonzentrationen führten eine nahezu vollständige Inhibition herbei, ebenso wie 8 µMPSC833. Eine Dosis von 0,78 µM Verapamil hingegen konnte den Efflux nichtstoppen.Ein Transport-Assay mit dem radioaktiv-markierten P-gp-Substrat Digoxin imTranswell-System diente einem weiteren Nachweis der Funktionalität des Proteins.Die Zellen wurden auf semipermeablen Membranen kultiviert. Die Konfluenz derZellschicht wurde mittels TEER-Messung (transepithelial electrical resistance)überprüft. Zellen mit TEER-Werten über 500 Omega wurden zum Versuch zugelassen undentweder von apikal oder von basal mit markiertem Substrat (10 nM, 100 nM, 1 µM,10 µM) beladen. Probenentnahmen aus dem gegenüberliegenden Kompartiment zuverschiedenen Zeitpunkten (5, 30, 60 und 90 Minuten) detektierten einen stärkerenSubstrat-Flux von basal nach apikal. Der Einsatz von Verapamil (250 µM) für dieInhibition des Digoxin-Fluxes (100 nM) zeigte eine Nivellierung beider Fluxrichtungenauf erhöhtem Fluxniveau. Der stärkere Flux von basal nach apikal wird auf den Effluxdurch das apikal lokalisierte P-Glycoprotein zurückgeführt. Für eine erfolgreicheInhibition des P-gp vermittelten Digoxin-Fluxes durch Verapamil spricht dieAngleichung der Stärke beider Fluxrichtungen. Die Niveauerhöhung wurde auf einein der Literatur berichtete Induktion von P-gp unter Verapamil-Einfluss zurückgeführt.Die nachweislich karunkuläre Herkunft der bovinen Zelllinie bietet im Vergleich zuanderen Zellmodellen, wie den in der Humanmedizin genutzten Choriocarcinoma-Zellinien oder den endometrialen Zellen nicht-trächtiger Rinder, den Vorteil derOrgan- und Funktionsspezifität. Gleichzeitig repräsentiert BCEC-1 aber vor allenDingen maternale Zellen des vierten Trächtigkeitsmonats. Rückschlüsse auf andereTrächtigkeitszeitpunkte sind nicht ohne Weiteres möglich. Desweiteren ist, mit Blickauf die fetus-protektive Funktion des P-gp, stets das fetale Kompartiment zuberücksichtigen. BCEC-1 stellt ein Teilstück der im Ablauf des plazentarenTransportes involvierten Anteile dar.BCEC-1 kann als bovines Zellmodell für die Ermittlung von buiatrisch genutzten,Transporter-spezifischen Substraten und deren Beförderung im maternalenKarunkelepithel herangezogen werden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler