Es wurde ein enzymimmunologisches Verfahren nach dem Sandwich-Prinzip zum Nachweis von Rinder-ZNS in Fleisch und Fleischerzeugnissen entwickelt. Das Verfahren basiert auf dem Nachweis von GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), dem Hauptbestandteil der Gliafilamente, mittels polyklonaler Antikörper.Zur Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen bovines GFAP wurden drei Kaninchen, zwei Schafe und zwei Schweine immunisiert. In allen Tieren konnte eine spezifische Immunantwort induziert werden. Die gewonnenen Antiseren wurden gereinigt und zur Herstellung von Antikörper-Meerrettichperoxidase (HRP)-Konjugaten verwendet. Die 49 möglichen Kombinationen aus Antiseren und Antikörper-HRP-Konjugaten wurden mittels GFAP und ZNS von Rind und Schwein insbesondere hinsichtlich ihrer Tierartspezifität überprüft. Die zum Nachweis von bovinem ZNS geeignetste Kombination aus Antiserum und Antikörper-HRP-Konjugat wurde ausgewählt und die optimale Konzentration der Immunreagenzien ermittelt. Die Nachweisgrenze für bovines GFAP lag unter diesen Bedingungen zwischen 4,1 und 12,3 ng/ml.Zur Ermittlung der optimalen Probenaufbereitung von Fleisch- und Fleischerzeugnissen wurden verschiedene Extraktionsmittel, Temperatur-Zeit-Kombinationen und Verdünnungsmedien miteinander verglichen. Die Probenaufbereitung, die die höchsten Extinktionen ergab, wurde verwendet, um aus ZNS einen internen Gehirnstandard zur direkten Quantifizierung des ZNS-Gehaltes in Proben zu erstellen. Unter diesen Bedingungen lag die Nachweisgrenze bei 1-3 µg Gehirnäquivalent (GÄq) / ml Extrakt.Die Überprüfung der Testsensitivität für den Nachweis von ZNS in Fleischerzeugnissen erfolgte durch Untersuchung künstlich mit Rindergehirn und rückenmark kontaminierter roher und erhitzter Fleischerzeugnisse: rohe Fleischerzeugnisse, die mindestens 0,5 % Rindergehirn oder 0,1 % -rückenmark enthielten, ergaben im Enzymimmuntest stets ein Messsignal oberhalb der Nachweisgrenze. Die Wiederfindungsraten für Rindergehirn betrugen durchschnittlich 86 % in rohen und 94 % in erhitzten Fleischerzeugnissen. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate für Rinderrückenmark betrug das 5,5-fache der durchschnittlichen Wiederfindungsrate für Rindergehirn.Zur Überprüfung der Tierartspezifität des Enzymimmuntests in Fleischerzeugnissen wurden rohe und erhitzte Fleischerzeugnisse mit definierten Mengen ZNS verschiedener Tierarten versetzt. Kontaminierte Proben mit mind. 1 % Schweinegehirn, 0,5 % Schweinerückenmark und 0,5 % Kaninchen-, Schafs- oder Pferdegehirn ergaben jeweils ein Messsignal oberhalb der Nachweisgrenze. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate für Schweinegehirn betrug ca. 1/3 der durchschnittlichen Wiederfindungsrate für Rindergehirn, während die Wiederfindungsraten für Schafgehirn geringgradig höher und für Pferde- und Kaninchengehirn geringgradig niedriger als für Rindergehirn waren. Mit Hühner- oder Putengehirn kontaminierte Proben ergaben keine Messsignale oberhalb der Nachweisgrenze.Der entwickelte Sandwich-Enzymimmuntest wurde mit einem kommerziell erhältlichen Enzymimmuntest zum Nachweis von ZNS in Fleischerzeugnissen, dem RIDASCREEN Risk Material Test von R-Biopharm, der ebenfalls bovines GFAP als Markerprotein verwendet, verglichen. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate betrug für Rindergehirn 82 % in rohen und 29 % in erhitzten Fleischerzeugnissen. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate für Schweinegehirn betrug 103 %. Für Schafsgehirn war die Wiederfindungsrate ca. doppelt so hoch wie für Rindergehirn, die Wiederfindungsraten für Kaninchen- und Pferdegehirn lagen bei ca. 1/3 der Wiederfindungsraten für Rindergehirn.Für die Überprüfung der Anwendbarkeit des Testsystems zur Untersuchung von Fleischerzeugnissen aus dem Handel auf ZNS-Kontamination wurden 30 Wurstwaren untersucht und ein Teil der Extrakte auch künstlich mit ZNS-Extrakt kontaminiert. In keiner der untersuchten Proben konnte ZNS nachgewiesen werden, die in künstlich kontaminierten Extrakten ermittelten Wiederfindungsraten betrugen zwischen 64 und 121 %.Durch immunaffinitätschromatographische Aufreinigung der Antiseren mit an Sepharose gekoppeltem bovinem und porcinem GFAP wurde versucht, eine weitere Spezifitätssteigerung zu erzielen. Sowohl die gereinigten Eluate der über boviner-GFAP-Sepharose getrennten Antiseren als auch die Probendurchläufe der Säule mit porciner-GFAP-Sepharose (subtraktive Immunaffinitätschromatographie) zeigten im indirekten Enzymimmuntest und im Sandwich-Enzymimmuntest keine Verbesserung der Speziesspezifität gegenüber den nicht aufgereinigten Antiseren.
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