Elektrophysiologische Charakterisierung der durch Listeriolysin O von Listeria monocytogenes und chromosomaler Punktmutanten induzierten Membranporen in humanen embryonalen Nierenzellen

Abstract

Das von L. monocytogenes sezernierte Toxin LLO induziert eine elektrophysiologisch darstellbare Porenbildung in der Zellmembran von Zielzellen. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass diese LLO-Poren unselektiv permeabel für monovalente Kationen wie Kalium und Natrium und divalente Kationen wie Calcium und Barium sind. Sowohl die Geschwindigkeit der Porenbildung als auch die Häufigkeit des Auftretens verschiedener Porengrößen konnten als konzentrationsabhängige Prozesse identifiziert werden. Erstmals konnte mit der vorliegenden Arbeit die Existenz einer LLO-Grundpore mit einer Leitfähigkeit von ca. 500 pS nachgewiesen werden. Diese Grundporen scheinen in Form von 'Clustern' in cholesterolreichen Regionen der Zellmembran der Zielzelle vorzuliegen und daher in unterschiedlicher Zahl zusammengeschaltet zu sein. Diese Schlussfolgerung ergibt sich aus dem beobachteten Auftreten höherer Porenleitfähigkeiten, die ganzzahlige Vielfache der Leitfähigkeit der Grundpore darstellen. Zudem spricht das Auftreten sog. 'sublevels' beim Öffnen und Schließen der Poren für diese Hypothese. Die LLO-Poren weisen in ihrem Öffnungs- und Schließungsverhalten unterschiedliche Charakteristika auf, die in dieser Arbeit erstmals untersucht wurden. Während Porenöffnungen immer sprunghaft ablaufen, sind Porenschließungen sowohl in einer sprunghaften als auch einer langsamen, eher exponentiell verlaufenden Form zu registrieren. Dieser langsame Porenschluss scheint zumindest teilweise ein Calcium-abhängiger Prozess zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass die einzelne Grundpore einen Mindestdurchmesser von ca. 0,7 nm aufweist und aus etwa drei Monomeren besteht. Die bisher in der Literatur beschriebenen, bei hohen Toxinkonzentrationen elektronenmikroskopisch sichtbaren 'Poren' würden somit einem Cluster von ca. 15 bis 30 Grundporen entsprechen. Sublytische Konzentrationen von LLO können eine Vielzahl an zellulären Interaktionen und intrazellulären Signalübertragungen beeinflussen, die Calcium-abhängig sind und durch eine Änderung der intrazellulären Calcium-Konzentration beeinflusst werden. Wir konnten zeigen, dass es nach Applikation sowohl der Listeriensuspension als auch des gereinigten LLOs zu einem Einstrom von extrazellulärem Calcium durch membranständige LLO-Poren und damit zu Veränderungen der intrazellulären Calcium-Konzentration kommt. Die intrazelluläre Calcium-Konzentration der Zielzelle kann somit ohne direkten Kontakt mit Listerien allein durch die LLO-Poren selbst beeinflusst werden. Unsere Messungen mit chromosomalen Punktmutanten von L. monocytogenes belegen eindrucksvoll, dass bestimmte Aminosäuren des LLO-Moleküls von entscheidender Bedeutung für die porenbildende Wirkung von LLO sind. So führt eine Punktmutation im sog. Undecapeptid an Position 492 zu einem fast vollständigen Verlust der porenbildenden Aktivität. Das Undecapeptid stellt eine hochkonservierte Region innerhalb der Familie der cholesterolabhängigen Zytolysine dar. Die mit den LLO-Mutanten gefundenen elektrophysiologischen Ergebnisse können nun als Basis dienen, um zu klären, ob bzw. wie bestimmte Mutationen in der cholesterolbindenden Domäne und besonders im Undecapeptid anderer Toxine dieser Familie die porenbildende Aktivität beeinflussen.