Therapie der Harnröhrenstriktur in vitro

Abstract

Der Einsatz autologer Urothelzellen im Großtiermodell für die Therapie der Harnröhrenstriktur erfordert die Prüfung von Qualität und Funktionalität der transplantierten Zellen. Ziel der Studie war es zu prüfen, ob der epitheliale Phänotyp von porcinen Blasenzellen in vitro erhalten bleibt. Zusätzlich wurde der Einfluss der Zellmarkierung für die Applikation im Großtiermodell und die Biokompatibilität des Trägermaterials stabilisierte Hyaluronsäure auf porcine Blasenzellen untersucht. Der epitheliale Phänotyp der porcinen Blasenzellen wurde hinsichtlich des Zytokeratinmusters immunzytochemisch und mittels Westernblot analysiert. In den in-vitro-Untersuchungen konnten keine signifikanten Veränderungen im Zytokeratinmuster bei den porcinen Blasenzellen in Passage 0 - 5 detektiert werden. Die porcinen Blasenzellen exprimierten vorwiegend CK8, CK17, CK18 und CK19. Das Zytokeratin 20, als Marker für die enddifferenzierten Schirmzellen, konnte in den kultivierten Blasenzellen nicht nachgewiesen werden. Für eine in-vivo-Applikation der autologen Blasenzellen wären die Passagen 2 und 3 zu empfehlen. Des Weiteren wurde der Einfluss der Zellmarkierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff PKH26 auf die Vitalität und auf die Proliferation von porcinen Blasenzellen charakterisiert. Parallel dazu wurden Untersuchungen zur Stabilität der PKH26-Markierung durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass der Fluoreszenzfarbstoff PKH26 keinen hemmenden Einfluss auf die Vitalität und die Proliferation von porcinen Blasenzellen hatte. Seine Halbwertszeit unter in-vitro-Bedingungen mit hohen Proliferationsraten lag bei 14 Tagen. Deshalb ist die PKH26-Markierung für eine In-vivo-Applikation im Großtiermodell geeignet.Überdies wurde die Biokompatibilität von stabilisierter Hyaluronsäure mit Dextranomer bezüglich Vitalität und Migration von porcinen Blasenzellen getestet. In einem Ko-Kulturmodell mit Fibroblasten wurde der Effekt von stabilisierter Hyaluronsäure und Dextranomer auf porcine Blasenzellen hinsichtlich des epithelialen Phänotyps (AE1/AE3) und der Morphologie im Rasterelektronenmikroskop (REM) und Transmissions-elektronenmikroskop (TEM) charakterisiert. In den in-vitro-Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass das Verhältnis 1:4 von stabilisierter Hyaluronsäure mit Kulturmedium für eine in-vivo-Applikation am besten geeignet scheint. Positive Immunfärbungen der porcinen Blasenzellen mit dem Pan-Zytokeratin Marker AE1/AE3 zeigten, dass der epitheliale Phänotyp der porcinen Blasenzellen nach Kultivierung mit stabilisierter Hyaluronsäure erhalten blieb. Allerdings zeigte sich eine deutlich aufgelockerte, wenig kompakte Struktur des Gewebes, resultierend aus den großen Dextranomer Molekülen. Diese Beobachtungen wurden in den REM-Aufnahmen morphologisch bestätigt. Die Urothelzellen lagerten sich um die Dextranomere an. In den TEM-Untersuchungen konnten in der Kontrolle (ohne Hyaluronsäure und Dextranomer) nach 1 und 3 Wochen Desmosomen, Tight-Junctions und apikale Membranen mit Uroplakin Einlagerungen nachgewiesen werden. In den mit Hyaluronsäure und Dextranomer inkubierten Ko-Kulturen ließen sich diese Strukturen nur nach 1 Woche Inkubationszeit darstellen. Die Daten zeigen eine gute Biokompatibilität von stabilisierter Hyaluronsäure als Trägermatrix für porcine Blasenzellen. Deshalb könnte die Suspension aus stabilisierter Hyaluronsäure und porcinen Blasenzellen eine neue Anwendung zur Therapie von Harnröhrenstrikturen mit autologen Urothelzellen im Großtiermodell sein.

The use of autologous urothelial cells in a large animal model for the therapy of the urethral strictures requires an examination of quality and functionality of the transplanted cells. The aim of this study was to monitor changes in epithelial phenotype of porcine bladder cells during cultivation. Furthermore, the influence of the cell labelling with the fluorescence dye PKH26, and the biocompatibility of the carrier material stabilized hyaluronic acid on viability, proliferation and morphology of porcine bladder cells should be investigated. The epithelial phenotype of the porcine bladder cells was analyzed immunocytochemically regarding to the cytokeratin pattern and also with western blot analysis. In the in vitro experiments no significant changes in the cytokeratin pattern of the porcine bladder cells could be detected in passage 0-5. The porcine bladder cells expressed predominantly CK8, CK17, CK18 and CK19. The cytokeratin 20, as marker for enddifferenciated umbrella cells, couldn t be detected in the cultivated bladder cells. Autologous bladder cells from passage 2 and 3 are suitable for an in vivo application in the large animal model. Moreover, the effect of the cell labelling using the fluorescence staining with PKH26 was investigated regarding to the viability and proliferation of porcine bladder cells. Additionally, the stability of the PKH26 staining was analyzed. The results demonstrated that the cell labelling with PKH26 had no inhibitory effect on the viability and proliferation of the porcine bladder cells. The half-life period of PKH26 under in vitro conditions with high proliferation rates was 14 days. Therefore the labelling with PKH26 for an in vivo application in a large animal model is suitable. Furthermore, the biocompatibility of stabilized hyaluronic acid with dextranomer was tested regarding to viability and migration of porcine bladder cells. The effect of stabilized hyaluronic acid and dextranomer on porcine bladder cells concerning to the epithelial phenotype (AE1/AE3) and the morphology in the scanning electron microscopy (REM) and transmission electron microscopy (TEM) was characterized in a co-culture model with fibroblasts. It could be shown, that the ratio 1:4 of stabilized hyaluronic acid with culture medium is the most suitable for an in vivo application. Positive immunohistochemistry of the porcine bladder cells with the pan-cytokeratin marker AE1/AE3 demonstrate that the epithelial phenotype of the porcine bladder cells remains intact after cultivation with stabilized hyaluronic acid. However, the lost of compact tissue structure could be observed as a result of the large dextranomer molecule. This result could be confirmed morphologically in the REM micrographs. The porcine bladder cells were arranged around the dextranomer molecules. In the TEM examinations cell-cell contacts like desmosoms and tight junctions, and also apikal membranes with uroplakin inclusions could be detected in the control group (without hyaluronic acid) after 1 and 3 weeks. In the co-culture incubated with hyaluronic acid and dextranomer these structures could be shown after 1 week of incubation time only. The data demonstrates a good biocompatibility of stabilized hyaluronic acid as matrix for porcine bladder cells. Therefore the suspension of hyaluronic acid and porcine bladder cells might be a new approach for the therapy of urethral stricture with autologous urothelial cells in a large animal model.