Untersuchung der Veränderungen des Lungenproteoms mittels pulsed-SILAC Markierung bei experimenteller Pulmonaler Hypertonie mit Tyrosinkinase-Inhibitor Therapie

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2014

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-14094

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Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine progressive verlaufende Erkrankung, die durch einen erhöhten pulmonalarteriellen Druck charakterisiert ist. In den Pulmonalarterien kommt es zur Vasokonstriktion und zu Umbauprozessen der Gefäßwände, dem sogenannten Remodeling. Diese Prozesse führen zur Verringerung des Gefäßlumens und zusammen mit der Vasokonstriktion zur progressiven Zunahme des pulmonalvaskulären Widerstandes. Der rechte Ventrikel kann diese gesteigerte Nachlast zunächst kompensieren, im Verlauf der Erkrankung kommt es aber zum Rechtsherzversagen.Es sind viele Signalwege bekannt, die in der PH eine Rolle spielen, dennoch ist diese Erkrankung bis heute nicht heilbar. Bisher zugelassene Therapien führen zur Vasodilatation und verringern darüber die Nachlast auf den rechten Ventrikel. Neue Therapieansätze zielen darauf ab, das Remodeling aufzuhalten oder sogar umzukehren (reverse Remodeling). Der Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib hat hierbei gute Erfolge im Tiermodell und klinischen Studien gezeigt.In der vorliegenden Arbeit wurde ein nicht-hypothesengelenkter Ansatz gewählt, um neue, bisher nicht beschriebene Signalwege der PH zu identifizieren. Es wurde das Rattenmodell der Monocrotalin (MCT)-induzierten PH verwendet, das gut die Remodeling-Prozesse der humanen PH abbildet und in dem die Wirksamkeit von Imatinib beim reverse Remodeling bereits gezeigt ist. Um die Veränderungen im Lungen-Proteom der Ratten untersuchen zu können, wurden die Tiere mit stabilen Isotopen markiert (stable isotope labeling of amino acids in cell culture, SILAC). Die Tiere wurden mit SILAC-Futter gefüttert, das schweres 13C6-Lysin enthält, in dem jedes 12C-Atom durch das stabile aber schwerere Isotop 13C ersetzt wurde. Die spezifische Massendifferenz zwischen dem schweren und dem leichten Lysin ermöglicht die Quantifizierung der im Massenspektrometer identifizierten Proteine. Die drei Gruppen Kontrolle, MCT/Placebo und MCT/Imatinib wurden für zwei Wochen mit dem SILAC-Futter gefüttert. Die Listen der identifizierten Proteine mit den 13C6-Lysin Einbauraten wurden mittels t-Test verglichen und eine Analyse zur Veränderung von GO-Termen durchgeführt.Bei den GO-Termen zeigen sich strukturelle Veränderungen der Zellkompartimente Membran, Vesikel und Zellverbindung, sowie Veränderungen bei Prozessen der Zelladhäsion für den Vergleich der Placebo- zur Kontroll-Gruppe. Beim Vergleich der Imatinib- zur Placebo-Gruppe sind katabole Stoffwechselprozesse hoch signifikant verändert.Der Vergleich der 13C6-Lysin-Inkorporation in einzelne Proteine mittels t-Test ergibt 19 hoch signifikant veränderte Proteine in der Placebo-Gruppe im Vergleich zur Kontroll-Gruppe, und 13 hoch signifikante veränderte Proteine in der Imatinib-Gruppe verglichen zur Placebo-Gruppe. Aus diesen wurden fünf Kandidaten ausgewählt und mittels Western Blot und immunhistochemischen Färbungen in Lungen von gesunden und MCT-Ratten nachgewiesen.Die Kandidaten Dysferlin, Emilin-1, HIP1, Septin-7 und Villin wurden mit dem nicht-hypothesengelenkten SILAC-Ansatz identifiziert und mit Antikörper-basierten Methoden nachgewiesen. Alle fünf Proteine sind bisher nicht im Zusammenhang mit PH beschrieben, sind aber in Pathomechanismen involviert, die auch in der PH beschrieben sind. In weiteren Studien kann jetzt die Rolle dieser Proteine in der humanen PH untersucht werden.

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