Untersuchung des Gallensäurestoffwechsels der Slc10a5 Knockout-Maus
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Zusammenfassung
Seit mehr als einem Jahrzehnt ist SLC10A5 nun Mitglied der Familie der natriumabhängigen Gallensäuretransporter. Diese Verwandtschaft ließ, basierend auf den Gründungsmitgliedern der SLC10 Familie NTCP und ASBT, schon früh die Hypothese aufkommen, dass SLC10A5 ebenfalls ein Protein der Gallensäurehomöostase ist. Die favorisierte Funktion war dabei die eines Gallensäuretransporters.Die erste Bestätigung dieser Theorie lieferte die Regulation von SLC10A5 durch den Kernrezeptor FXR, der das Haupt-Steuerglied der Gallensäurehomöostase ist. Eine Funktion von SLC10A5 als Transportprotein für Gallensäuren konnte bislang nicht gezeigt werden. In dieser Arbeit wurde eine potentielle Transportfunktion von SLC10A5 weiter untersucht. Dazu wurden zum einen Zellen genutzt, die eine stabil transfizierte Chimäre aus SLC10A5 und dem C-Terminus von NTCP in das Genom eingebaut hatten und dadurch eine Plasmamembranlokalisation von SLC10A5 ermöglichten. Zum anderen wurden Membranvesikel aus stabil transfizierten SLC10A5 Zellen generiert, in denen ein Transport gezeigt werden sollte. Aber auch in diesen Messungen konnte keine Transportaktivität von SLC10A5 für die untersuchten Gallensäuren gezeigt werden.Der zweite Teil der De-Orphanisierung von SLC10A5 war die subzelluläre Lokalisation. Bereits in vorangegangenen Experimenten und Arbeiten zeigte sich ein streng intrazelluläres Expressionsmuster des Proteins, das der Expression bereits beschriebener Mitglieder der SLC10-Familie widersprach. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses intrazelluläre Expressionsmuster in Leber- und Nierenschnitten von Mäusen durch die Verwendung eines speziell gegen den C-Terminus von SLC10A5 generierten Antikörpers bestätigt. Die Spezifität dieses Antikörpers konnte in Schnitten von Slc10a5-/- Knockout-Mäusen verifiziert werden. Die subzelluläre Lokalisation von SLC10A5 sollte durch Kolokalisation des Proteins mit organellenspezifischen Markern in der Lebendzellmikroskopie untersucht werden. Hier zeigten sich die größten Überschneidungen der Signale im endo-lysosomalen Apparat und dem ER. Eine Anreicherung des fluoreszenzmarkierten SLC10A5 im endo-lysosomalen Apparat war vermutlich auf die physikochemischen Eigenschaften des Fusionsproteins und die artifizielle Überexpression und Degradierung im Zellkulturmodell zurückzuführen. Im Kontext vorangegangener Arbeiten und dem intrazellulären Gallensäurestoffwechsel ist die Lokalisation im ER die favorisierte physiologische Lokalisation von SLC10A5 in dieser Arbeit.Aufbauend auf dem Pilotversuch mit der Slc10a5-/- Knockout-Maus von Aretz (2015), der einen massiven Einfluss von SLC10A5 auf die Entgiftung des mit Cholsäure überladenen Enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren zeigte, sollte in der vorliegenden Arbeit eine Funktion von SLC10A5 unter physiologischen Bedingungen und ein Anteil am Energiestoffwechsel gezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass in der männlichen Slc10a5-/- Knockout-Maus unter Standardhaltungsbedingungen die Konzentrationen der konjugierten Gallensäuren Taurodeoxycholat und Taurohyodeoxycholat in der Galle und deren dekonjugierte Formen im Darminhalt signifikant erhöht waren. Zusätzlich waren höhere Deoxycholat-Konzentrationen im Blut des peripheren Kreislaufs messbar. In den weiblichen Mäusen traten keine signifikanten Unterschiede der Gallensäureprofile auf. Diese Ergebnisse deuten zumindest in den männlichen Tieren darauf hin, dass SLC10A5 gemeinsam mit Cytochrom P450 Oxidasen an der Rehydroxylierung sekundärer Gallensäuren im ER von Leberzellen beteiligt sein könnte. Eine Beeinträchtigung des Energiestoffwechsels der Slc10a5-/- Knockout-Maus konnte nicht gezeigt werden. Verschiebungen der Hydrophobizitätsindizes des Gallensäurepools in der Galle, dem peripheren Blut und dem Kot zeigen jedoch, dass der Verlust von SLC10A5 auch unter normalen Bedingungen einen Einfluss auf die physiologische Balance des Gallensäurestoffwechsels von Mäusen hat und eröffnet ein breites Spektrum an Untersuchungsmöglichkeiten für zukünftige Arbeiten mit SLC10A5Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Gießen : http://www.dvg.net/ DVG Service GmbH