Das cholesterolabhängige Zytolysin Listeriolysin O (LLO) ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor des grampositiven Bakteriums Listeria (L.) monocytogenes und erfüllt im Verlauf einer Infektion verschiedene wichtige Funktionen. Dazu gehören die Induktion verschiedener Zellreaktionen bei sublytischen LLO-Konzentrationen und die Lyse von zellulären Membranen bei hohen LLO-Konzentrationen. Diese Wirkungen werden größtenteils durch die von LLO gebildeten Membranporen vermittelt. Die vorliegenden Arbeit beschäftigt sich in erster Linie mit der Charakterisierung der Eigenschaften dieser Poren. Weitere Schwerpunkte sind die Untersuchung der lytischen Wirkungvon LLO und seiner Bedeutung für die Invasion von L. monocytogenes in Wirtszellen.
Ein besonderes Merkmal der LLO-Poren, die mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik an HEK293-Zellen untersucht wurden, ist das Auftreten von Porenschlüssen. Diese Schlüsse waren in der zellfreien Outside-Out-Konfiguration seltener und bei menschlichen Erythrozyten fast gar nicht zu beobachten. Sie beruhen demnach vermutlich auf einer endozytotischen Elimination der Poren von der Oberflächenmembran. Dieser Elimnationsprozess ist offensichtlich stark von dem durch die LLO-Poren vermittelten Calcium-Einstrom abhängig und wird durch eine Destabilisierung des Aktin-Zytoskeletts erleichtert.
Es ist bekannt, dass bei der Befreiung von L. monocytogenes aus dem Phagosom von Wirtszellen neben LLO zwei von den Listerien sezernierte Phospholipasen C von Bedeutung sind. Mit Hilfe einer Deletionsmutante, die diese Enzyme nicht exprimiert, konnte jedoch gezeigt werden, dass die listeriellen Phospholipasen C zumindest extrazellulär keinen Einfluss auf die Porenbildung haben.
Es zeigte sich, dass zur Hämolyse etwa 10-fach höhere LLO-Konzentrationen erforderlich sind als zur sublytischen Porenbildung. Die hämolytische Wirkung cholesterolabhängiger Zytolysine lässt sich charakteristischerweise durch Thiole und andere reduzierende Agenzien verstärken. Mit Hilfe von Patch-Clamp-Experimenten konnte auch eine Aktivierung sublytischer LLO-Poren nachgewiesen werden. Die Verstärkung des LLO-induzierten Ladungsflusses über die Zellmembran in Anwesenheit von Thiolen ist nur teilweise durch das vermehrte Auftreten hoher Porenstromamplituden zu erklären. Als weiterer Faktor ist eine Verlängerung der Porenoffenzeiten in Betracht zu ziehen. Möglicherweise ist die Thiol-Aktivierbarkeit wichtig für die kompartimentspezifische Wirkung von LLO. Am Modell menschlicher Larynxkarzinomzellen konnte die Invasion von L. monocytogenes durch Zugabe von Thiolen erhöht werden. Daher ist denkbar, dass physiologische oder pharmakologische Erhöhungen der Thiol-Konzentration im Plasma die Pathogenität von L. monocytogenes verstärken.
Aufgrund der hohen Bedeutung von LLO-Poren für die Pathogenität von Listerien stellt deren Verhinderung oder Blockade einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie von Listerieninfektionen dar. In der vorliegenden Arbeit gelang es, die LLO-Porenbildung an HEK293-Zellen durch Vorinkubation mit nanomolaren Konzentrationen des Polypeptids Protamin nahezu vollständig zu blockieren. Auch die hämolytische Aktivität von LLO ließ sich auf diese Weise unterbinden. In Invasionsexperimenten wurde belegt, dass die Hemmung der Porenbildung auch einen wirksamen Schutz vor der Invasion von L. monocytogenes in Wirtszellen bietet. Der Wirkmechanismus von Protamin beruht offensichtlich in erster Linie auf einer Wechselwirkung mit der Zelle. Allerdings scheint Protamin die Invasion zusätzlich auch über einen porenunabhängigen Mechanismus zu beeinflussen und hemmt selbst die Invasion LLO-defizienter Mutanten. Da Protaminsulfat die Invasion ebenso eindrucksvoll verhinderte und für diese Substanz bereits pharmakotherapeutische Erfahrungen am Menschen vorliegen, lassen diese Ergebnisse auf einen möglichen klinischen Nutzen bei Listerieninfektionen hoffen.
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