Die quantitative Real-Time PCR hat sich als eine etablierte, präzise und sensitive Methode zur Genexpressionsanalyse erwiesen. Alle Schritte der Probenaufbereitung von der Probengewinnung bis zur Real-Time PCR stellen jedoch potentielle Quellen methodischer Fehler dar.
Die RNA-Isolierung und insbesondere die Reverse Transkription konnten in dieser Arbeit als Hauptverursacher der methodischen Fehler identifiziert werden. Die Protokolle wurden optimiert, um solche methodischen Fehler zu minimieren, die sich auf verschiedene Gene in verschiedenem Maße auswirken (genspezifische methodische Fehler). Die Anwendung eines validen Protokolls ist essentiell, da diese genspezifischen Fehler im weiteren Verlauf der Genexpressionsanalyse nicht mehr ausgeglichen werden können.
Die Verwendung eines Housekeeping-Gens als Referenz für die Expression des zu untersuchenden Zielgens stellt eine Möglichkeit dar, solche methodische Fehler zu kompensieren, die auf alle Gene gleich wirken (globale methodische Fehler). Die Validität dieses Vorgehens steht und fällt jedoch mit des Validität der Housekeeping-Gens, das in allen untersuchten Proben möglichst konstant exprimiert sein muss. Bei der Evaluation von potentiellen Housekeeping-Genen müssen jedoch genau diejenigen globalen methodischen Fehler berücksichtigt werden, die das Housekeeping-Gen später kompensieren soll. Es wurde daher ein neues Protokoll etabliert, um einzelsträngige cDNA präzise zu quantifizieren. Der Gesamt-cDNA-Gehalt der einzelnen Proben diente bei der Evaluation von zehn potentiellen Housekeeping-Genen als Bezugspunkt, um globale methodische Fehler auszugleichen. 18S, PBGD und CASQ2 konnten für die untersuchten Myokardproben von Patienten mit Fallotscher Tetralogie (TOF) als valide Housekeeping-Gene identifiziert werden.
Für die Real-Time PCR selbst konnte die Sensitivität und Präzision der Methode auch für extrem niedrige Konzentrationen von bis zu einem Molekül Nukleinsäure pro Reaktion nachgewiesen werden. Dies hat direkte klinische Konsequenzen, beispielsweise bei der Diagnostik und Verlaufskontrolle der Minimal Residual Disease.
Im nicht-ischämischen RV Myokard von Patienten mit Fallotscher Tetralogie konnte entgegen anders lautender Voruntersuchungen die Expression von HIF1A, VEGF und dessen Rezeptoren nachgewiesen werden. HIF1A scheint dabei auch auf mRNA-Ebene reguliert zu sein. Für die natriuretischen Peptide ANP und BNP sowie für HIF1A, VEGF und dessen Rezeptoren VEGF-R1 und VEGF-R2 konnte der in der Literatur beschriebene Altersverlauf nachvollzogen werden, wobei ein Wiederanstieg von VEGF-121 in den adulten Kontrollproben auffällig war. Vor dem Hintergrund der differenten Altersstruktur der Kontrollgruppe und der Gruppe der Patienten mit Fallotscher Tetralogie konnte die erwartete gesteigerte Expression der untersuchten Gene in den TOF-Proben nur für VEGF-R1 gezeigt werden. Für ANP und BNP zeigte sich sogar eine verminderte Expression in den TOF-Proben. Diese könnte auf den lokalen Unterdruck am Ort der Biopsieentnahme im Sinne des Bernoulli-Effekts zurückzuführen sein. Eine Abhängigkeit von klinischen Parametern wie dem rechtsventrikulären Druck oder der arteriellen Sauerstoffsättigung zeigte sich nicht. Die Korrelationen der Gene untereinander können Anlass zu Hypothesen bezüglich der Regulation dieser Gene sein. HIF1A und VEGF-189 könnten bei der Regulation der VEGF-Rezeptoren eine stärkere Rolle spielen als VEGF-121 oder VEGF-165. Außerdem könnten die natriuretischen Peptide und die angiogenetischen Wachstumsfaktoren enger miteinander verknüpft sein als bisher angenommen. Weiterführende Studien müssen die so generierten Hypothesen überprüfen.
Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
