Chondrogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen auf Polymerscaffolds

Abstract

Als avaskuläres Gewebe besitzt hyaliner Knorpel nur ein geringes Regenerationspotential. Chondrale Defekte werden mit dem widerstandsfähigeren, gleichzeitig weniger elastischen und somit auch weniger stoßdämpfenden Faserknorpel ersetzt, sodass sich Defekte immer tiefer fortpflanzen. Trotz vielfältiger Therapieansätze stellen osteochondrale Defekte weiterhin eine große Herausforderung im klinischen Alltag dar. Arthrose als häufigste degenerative Gelenkerkrankung nimmt weltweit durch eine steigende Lebenserwartung drastisch zu. In diesem BMBF-Projekt wurden Implantate aus synthetisierten Polymeren entwickelt, welche entweder über Laktat (Poly-(D,L)-Laktid-ε-Caprolacton, LCM3) oder über Aminosäuren (Polyamid-ε-Caprolacton, ACM) degradieren. Zusätzlich wurden die Scaffolds mit einer gerinnungshemmenden Heparinbeschichtung (LCM3H, ACMH) hergestellt. Mit dieser in vitro Studie wurde die chondrogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC) an den unterschiedlichen Polymeren untereinander und mit einer Kontrolle in chondrogenem Differenzierungsmedium (Chondro), sowie hMSC in Kontrollmedium (Kontrolle) verglichen, um eine Empfehlung für den Einsatz in einem biphasischen Scaffold für den chondrogenen Anteil zu geben. Die Polymere wurden dafür in Ronden mit einer Höhe von 1 mm und einem Durchmesser von 7 mm gegossen. Im Rahmen einer endoprothetischen Hüftgelenks-Versorgung männlicher Patienten (n = 6) wurde aus dem nicht mehr benötigten Knochengewebe der Hüftköpfe hMSC isoliert. Es folgte die chondrogene Differenzierung der hMSC unter Verwendung der Wachstumsfaktoren TGF-ß1, BMP-2 und durch den vorübergehenden Einsatz von DMOG an den Ronden jeweils mit und ohne Heparinbeschichtung. An den Versuchstagen 5, 10 und 15 wurde die Expression ausgewählter chondrogener Differenzierungsmarker durch real-time RT-PCR bestimmt. Zudem wurde an Tag 5 ein MTT-Assay durchgeführt und die Zellkulturüberstände von Tag 5 in einem IL-6 ELISA verwendet. An Tag 20 wurden Zellen für einen Kollagen II ELISA geerntet. Die statistische Analyse erfolgte mit dem Kruskal-Wallis-Test unter Verwendung von SPSS. TRPV4 als früher chondrogener Marker zeigte in der relativen Genexpression für das Material ACMH eine signifikante Reduktion im Vergleich zu Chondro (p = 0,037). Die mRNA-Expression des frühen chondrogenen Differenzierungsmarkers SOX9 war signifikant höher an den Scaffolds aus LCM3 (p = 0,029) und LCM3H (p = 0,031) im Vergleich zu den Zellen im Kontrollmedium. Bei den späteren Differenzierungsmarkern konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Materialien nachgewiesen werden. Der IL-6-Gehalt des Zellmediumsüberstandes war an keinem der Materialien signifikant erhöht. Die metabolische Aktivität der Zellen an LCM3 und LCM3H erwies sich als signifikant höher als derer an ACM und ACMH. Im Kollagen II ELISA wurde signifikant mehr Kollagen Typ II in den Zellen an LCM3, LCM3H und ACM im Vergleich zu Chondro festgestellt (p < 0,05). In der Zusammenschau der Ergebnisse zeigen die Zellen an den Polymeren aus LCM3 ein besseres Differenzierungsverhalten und metabolische Aktivität als die Zellen an ACM, wobei der Kontakt zu keinem der Materialien zu einer vermehrten Expression proinflammatorischen IL-6 führte. Auf Proteinebene scheinen sich die Zellen besser an den Materialien differenziert zu haben als sogar in der chondrogenen Differenzierungsgruppe ohne Materialkontakt. Bei beiden Materialien erwies sich eine zusätzliche Heparinbeschichtung als nachteilig. Ob durch einen gewebeschonenderen Abbau von ACM ein späterer Vorteil entsteht, müssen nun Langzeituntersuchungen nachgehen.