Einfluss verschiedener Leukozyten und von Zellkulturüberständen auf die zytotoxische Aktivität von aus Hundeblut isolierten Effektorzellen
Lade...
Datum
Autor:innen
Betreuer/Gutachter
Weitere Beteiligte
Beteiligte Institutionen
Herausgeber
Zeitschriftentitel
ISSN der Zeitschrift
Bandtitel
Verlag
Lizenz
Zitierlink
Zusammenfassung
1.Im Literaturteil wird ein kurzer Überblick über Morphologie und Funktion von Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) sowie den Mechanismus ihrer Zytotoxizität gegeben. Da im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von anderen Leukozytenarten auf die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen untersucht werden sollte, erfolgen zunächst Angaben bezüglich der Isolierung von Lymphozyten aus Blut, sowie der Depletion kontaminierender Leukozytenarten, speziell von Monozyten sowie CD4+- und CD8+-Zellen. Auch die Messmethode der zytotoxischen Aktivität der im Isolat enthaltenen Zellen wird kurz dargestellt. Außerdem wird der bisher bekannte Einfluss einzelner Leukozytenarten auf die Zytotoxizität beschrieben. 2.Die beim Menschen bereits beschriebene und besonders ausgeprägte zytotoxische Aktivität sogenannter adhärenter NK-Zellen (A-NK) wird diskutiert. Um einen Einfluss der Adhärenz an Plastikoberflächen auf Zellzusammensetzung und Zytotoxizität zu untersuchen, wurde jeweils vor und nach der Depletion plastikadhärenter Leukozyten sowohl ein Zytotoxizitätstest als auch eine Bestimmung der relativen Zellanteile durchgeführt. Dabei stellten sich die relativen Anteile isolierter Lymphozyten und neutrophiler Granulozyten nach Adhärenz nahezu unverändert dar. Monozyten und eosinophile Granulozyten zeigten jeweils eine Reduktion ihres relativen Zellanteils nach Adhärenz. Diese erwies sich allerdings nur hinsichtlich der eosinophilen Granulozyten als statistisch schwach signifikant (p = 0,02). Die von einigen Autoren beschriebene effektive Monozytendepletion durch Adhärenz bestätigte sich nach den hier vorliegenden Ergebnissen für den Hund nicht. Bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 50:1 konnte nach Adhärenz eine statistisch signifikante Reduktion der zytotoxischen Aktivität um knapp die Hälfte beobachtet werden (p = 0,01). Dies könnte ein Hinweis auf die Existenz adhärenter NK-Zellen beim Hund sein, da bei Differenzierung der adhärenten Zellen Lymphozyten nachgewiesen werden konnten. Eine mögliche Beteiligung anderer adhärenter Zellen (beispielsweise Monozyten und eosinophile Granulozyten) an der spontanen zytotoxischen Aktivität ist aufgrund dieser Ergebnisse zwar nicht sicher auszuschließen, direkte Hinweise darauf konnten allerdings nicht ermittelt werden. 3.Zur Erzielung einer effektiveren Monozytendepletion wurde die Adhärenz mit einer Carbonyleisenzugabe zu den isolierten Zellen kombiniert. Mit einem p-Wert von p = 0,007 stellte sich die auf diesem Weg erreichte weitere Reduktion der Monozyten zwar als signifikant heraus, eine vollständige Monozytendepletion konnte allerdings auch hierdurch nicht erzielt werden. Ein signifikanter Einfluss der Carbonyleisenphagozytose auf die relativen Anteile der anderen isolierten Leukozytenarten, nämlich von Lymphozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten konnte nicht nachgewiesen werden. Bei dem Vergleich der zytotoxischen Aktivität ohne bzw. nach Zugabe des Carbonyleisens ergab sich ein statistisch nicht signifikantes Absinken der Zytotoxizität von 20,2 % nach alleiniger Adhärenz auf 10,9 % nach kombinierter Adhärenz und Carbonyleisenphagozytose. Ob diese Reduktion nur durch Monozyten oder auch durch neutrophile bzw. eosinophile Granulozyten bedingt ist, kann aufgrund vorliegender Ergebnisse nicht sicher beantwortet werden. 4.Die Depletion CD4+-Zellen erfolgte mittels immunomagnetischer Separation. Dabei wurde der spezifische Antikörper Rat anti-Dog CD4 eingesetzt. Die Depletion von CD4+-Zellen resultierte in einer signifikanten Erniedrigung der Gesamtleukozytenzahl, die allerdings nicht nur auf eine Depletion CD4+-Zellen zurückzuführen ist. Vielmehr müssen auch andere Leukozytenarten bei der Depletion verloren gehen. Eine unspezifische Bindung dieser Zellen an Dynabeads® mit ihrem bereits gekoppelten Sekundärantikörper Sheep anti-Rat konnte in Vorversuchen ausgeschlossen werden. Ob der Zellverlust auf eine Adhärenz der Leukozyten an der Oberfläche des verwendeten Zentrifugenröhrchens zurückzuführen ist, konnte nicht geklärt werden. Ein Einfluss CD4+-Zellen auf die Zytotoxizität konnte bei keinem untersuchten Effektor-Zielzellverhältnis beobachtet werden. Die Zytotoxizität stellte sich vielmehr im Vergleich vor und nach Depletion CD4+-Zellen nahezu unverändert dar (p > 0,05). Dieses Ergebnis weist klar darauf hin, dass CD4+-Zellen nicht an der Auslösung der spontanen zytotoxischen Aktivität beim Hund beteiligt sind. 5.Nach immunomagnetischer Separation von CD8+-Zellen mittels eines an Dyna¬beads® Sheep anti-Mouse gekoppelten spezifischen Antikörpers (Mouse anti-Dog CD8) konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Gesamtleukozytenzahl beobachtet werden. Diese Reduktion ist allerdings nicht nur auf eine Depletion CD8+-Zellen zurückzuführen, sondern wie bei der Depletion CD4+-Zellen gingen auch andere Leukozytenarten bei dieser Methode verloren. Die Ermittlung der zytotoxischen Aktivität erfolgte bei unterschiedlichen Effektor-Zielzellverhältnissen. Bei einer E/T ratio von 100:1 konnte dabei gegenüber CTAC-Zellen ein nicht signifikanter Anstieg der zytotoxischen Aktivität nach Depletion CD8+-Zellen um den Faktor 1,5 beobachtet werden. Bei Untersuchung der Effektor-Zielzellverhältnisse 50:1 und 25:1 konnte jedoch kein bzw. nur ein geringgradiger, nicht signifikanter Anstieg der zytotoxischen Aktivität verzeichnet werden (p > 0,05). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass CD8+-Zellen ebenfalls keinen bedeutenden Einfluss auf die spontane Zytotoxizität von kaninen NK-Zellen nehmen. Der bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 100:1 beobachtete Anstieg der Zytotoxizität ist vermutlich auf eine Anreicherung der Effektorzellen im Isolat zurückzuführen. Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass beim Hund die spontane Zytotoxizität im Wesentlichen auf NK-Zellen beruht. 6.Nach Koinkubation von Ziel- und Effektorzellen konnte keine zytotoxische Aktivität von löslichen zytotoxischen Faktoren im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden (p = 0,002). Demzufolge ist beim Hund ein direkter Zell-zu-Zellkontakt zwischen Ziel- und Effektorzellen für die Auslösung der spontanen Zytotoxizität von entscheidender Bedeutung, lösliche zytotoxische Faktoren im Zellkulturüberstand spielen hierbei offenbar keine Rolle. 7.Da alle in vorliegender Arbeit nach der Percoll®-Isolierung angewendeten Aufreinigungsverfahren mit einem hohen Zellverlust einhergehen, sollte überprüft werden, ob eine weitere Aufreinigung der Percoll®-isolierten Effektorzellen für den Einsatz im Zytotoxizitätstest überhaupt sinnvoll ist. Zwischen dem Anteil isolierter Lymphozyten und der Höhe der Zytotoxizität ergab sich weder bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 100:1 noch bei einer E/T ratio von 50:1 ein statistisch gesicherter Zusammenhang (p > 0.05). Inwieweit ein Nutzen aus zusätzlichen Aufreinigungsverfahren, die signifikant mit einer Reduktion der Gesamtleukozytenzahl verbunden sind, gezogen werden kann, muss daher je nach Untersuchungsziel überdacht werden. Zumindest ist bei einer starken Kontamination der isolierten Lymphozyten mit anderen Leukozytenarten das Effektor-Zielzellverhältnis nur schlecht einzustellen, da als Effektorzellen in erster Linie die Gruppe der Lymphozyten mit den darin enthaltenen NK-Zellen entscheidend sind. 8.Weiterhin wurde der in der Literatur diskutierte Einfluss äußerer Faktoren auf die zytotoxische Aktivität untersucht. Dazu wurde die jeweils mittlere zytotoxische Aktivität von Klinikhunden, die unter standardisierten Bedingungen gehalten wurden, mit der von Hunden aus privatem Besitz bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 100:1 bzw. 50:1 direkt nach Percoll®-Isolierung verglichen. Die Privathunde wiesen bei einer E/T ratio von 100:1 mit einem p-Wert von 0,003 eine signifikant höhere mittlere Zytotoxizität auf (60,1 % im Vergleich zu 28,7 %). Auch bei der E/T ratio von 50:1 zeigten die Privathunde eine geringgradig höhere mittlere Zytotoxizität, die sich allerdings als nicht signifikant darstellte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Haltung und möglicherweise damit verbundene Stressfaktoren der Tiere einen Einfluss auf das Immunsystem und auf die spontane zytotoxische Aktivität nehmen. Das für den Menschen beschriebene Low-NK-Syndrom, welches mit erniedrigter NK-Aktivität einhergeht und häufig bei deprimierten und gestressten Personen auftritt, könnte somit auch beim Hund vorkommen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Gießen : VVB Laufersweiler 2008