Nachweis und DNA-Fingerprinting von Escherichia coli O157-Stämmen bei Pferden
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Zusammenfassung
Wiederkäuer gelten als Hauptreservoir der verotoxinogenen Escherichia coli (VTEC). Die als potentiell hochvirulent einzustufenden Serovare O157:H7 und O157:H- werden in Deutschland jedoch nur selten bei landwirtschaftlichen Nutztieren nachgewiesen. In geringerem Umfang können VTEC auch bei anderen Haus- und Wildtierspezies isoliert werden. In der Literatur finden sich Berichte über den Nachweis von E. coli O157 bei Pferden, die in Zusammenhang mit humanen Erkrankungsfällen standen. In Bayern wurde ein Sorbit-fermentierender (SF) E. coli O157:H--Stamm bei Minipferden isoliert, die als Infektionsquelle für ein an hämolytisch-urämischem Syndrom (HUS) erkranktes Kind vermutet wurden. Bislang konnte das Reservoir dieser offenbar hochvirulenten SF E. coli O157:H--Stämme noch nicht identifiziert werden; bei Wiederkäuern gelang der Nachweis solcher Stämme nur vereinzelt. Aufgrund biochemischer Unterschiede wird dieser Klon von den für E. coli O157:H7 gebräuchlichen kulturellen Verfahren nicht erfaßt. In der vorliegenden Arbeit sollte nun das Vorkommen von E. coli der Serogruppe O157 unter besonderer Berücksichtigung der SF E. coli O157:H--Stämme bei Pferden untersucht werden. In die eigenen Untersuchungen wurden 100 Pferdekotproben einbezogen. Zur Optimierung der Nachweismethodik wurden die ersten 51 Proben vergleichend in zwei Selektivanreicherungen (modifizierte Trypton-Soja-Bouillon [mTSB] und gram negative broth [GN] nach HAJNA) in Kombination mit der immunomagnetischen Separation (IMS), sowie im Direktausstrich ohne IMS untersucht. Die Subkultivierung erfolgte in allen Ansätzen auf Hemorrhagic Colitis-Agar nach SZABO (HC), da dieser auch das Wachstum Tellurit-sensitiver Organismen wie SF E. coli O157:H--Isolate erlaubt. Um letztere mitzuerfassen, wurden nach Subkultivierung zusätzlich zu den jeweils zehn Sorbit-negativen Kolonien auch zehn Sorbit-positive Kolonien mit einem kommerziell erhältlichen E. coli O157-Latex-Test überprüft. Da mit der Kombination mTSB-Bouillon und IMS 94,1 % aller insgesamt E. coli O157-positiven Proben erfaßt werden konnten, wurde diese Untersuchungsvariante für die nachfolgenden 49 Fäzesproben ausschließlich eingesetzt. Präsumtive E. coli O157-Isolate wurden nach biochemischer Bestätigung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Verotoxin- und eae-Gen(e) untersucht. Bei einer repräsentativen Auswahl an Isolaten wurde weiterhin die Serogruppenzugehörigkeit durch PCR bestätigt, das für das H-Antigen codierende fliC-Gen mit Hilfe eines Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Tests (RFLP) charakterisiert, sowie die Fähigkeit zur Hämolyse überprüft. Weiterhin wurde der Grad der genetischen Verwandtschaft der Isolate untereinander sowie im Vergleich zu zwei Referenzstämmen mittels Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) untersucht.In 61 Proben (61%) konnten mit O157-Antiserum agglutinierende Kolonien nachgewiesen und genotypisch bestätigt werden. Von insgesamt 329 Isolaten zeigten 205 Sorbit-Fermentierung (62,3%), 124 waren Sorbit-negativ (37,7%). Alle zeigten auf HC-Agar Fluoreszenz. 24 Isolate (7,3%) waren Indol-negativ und biochemisch nicht eindeutig als E. coli zu identifizieren. Bei keinem der Isolate konnte das eae-Gen oder Verotoxin-Gene detektiert werden; ebenso war keine Hämolyse zu beobachten. Die Restriktionsmuster waren nicht mit dem von O157:H7-Stämmen identisch. In der PFGE zeigten die 92 untersuchten Isolate 53 verschiedene Restriktionsmuster, die sich zu acht Clustern zusammenfassen ließen. Die zwei einbezogenen Referenzstämme, ein O157:H7-Isolat sowie ein von den o. e. Minipferden gewonnenes SF VTEC O157:H--Isolat, konnten jedoch keinem Cluster zugeordnet werden. Nach diesen Untersuchungen stellen Pferde kein Reservoir für verotoxinogene E. coli O157:H7/H- dar. Auffallend ist jedoch das regelmäßige Auftreten von Verotoxin-negativen Isolaten dieser Serogruppe. Das Vorkommen solcher Isolate wurde in der Literatur bereits bei einer Vielzahl unterschiedlicher Probenarten beschrieben, wenngleich nicht mit der hier gefundenen Häufigkeit. Bei Untersuchungsmethoden, die lediglich auf dem Nachweis der Serogruppe O157 beruhen, ist also bei der Interpretation eines positiven Befundes Vorsicht geboten. Ohne weitergehende Untersuchungen zum Pathogenitätspotential läßt sich daraus noch keine Bedeutung als möglicher Krankheitserreger ableiten. Diese Ergebnisse unterstützen die Forderung nach Serovar-unabhängigen VTEC-Nachweismethoden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2005