Etablierung eines ELISpot-Assays zur Detektion von Antikörpern gegen Beta-3-Integrine

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2019

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-14884

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HintergrundZiel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines B-Zell-ELISpot-Assays (Enzyme Linked Immuno Spot Assay) zur Detektion von Antikörpern gegen beta3-Integrine. Mütterliche Antikörper gegen das humane Plättchenantigen 1a (HPA-1a) sind die häufigste Ursache der Fetalen und Neonatalen Alloimmunthrombozytopenie (FNAIT). Das Antigen HPA-1a ist durch einen Aminosäureaustausch in der beta3-Integrinkette charakterisiert. Kürzlich konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass bestimmte mütterliche anti-HPA-1a Antikörper mit fetaler Hirnblutung assoziiert sind. Diese Antikörper reagieren mit dem Vitronektin-Rezeptor (alphaV beta3-Integrin) und induzieren eine funktionelle Störung des Endothels. Dieser Subtyp von anti-HPA-1a Antikörpern wurde bei Müttern von Neugeborenen ohne Hirnblutung nicht gefunden. Bei Müttern von Neugeborenen ohne Hirnblutung wurden Antikörper nachgewiesen, die gegen den Fibrinogen-Rezeptor (alphaIIb beta3) gerichtet sind. Die beiden Antikörper-Subtypen erkennen somit die beta3-Integrin-Kette im Verbund mit einer jeweils anderen alphaKette (Verbund- abhängiger (compound-dependent) Antikörper). Ein weiterer Antikörper-Subtyp erkennt das HPA-1a Antigen auf der beta3-Integrin-Kette unabhängig von dem Verbund mit einer alpha-Kette. Da Antiseren von Müttern mit FNAIT immer ein polyklonales Gemisch zahlreicher Antikörpermoleküle repräsentieren, ist die Gewinnung und Charakterisierung von murinen und humanen monoklonalen Antikörpern für die Pathogeneseforschung, für die Entwicklung von Nachweisverfahren zur Risikostratifizierung sowie zur Entwicklung neuer Medikamente zur Prophylaxe fetaler Blutungen unverzichtbar.Mittels B-Zell-ELISpot-Assay können einzelne, Antikörper-sezernierende Zellen in einer Mikrotiterplatte in situ nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese untersucht, dass der B-Zell-ELISpot-Assay ein geeignetes Verfahren zur Charakterisierung von Hybridomzellen und damit zur Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper gegen beta3-Integrine darstellt. In einer zweiten Phase sollte untersucht werden, ob das gleiche Nachweisverfahren auch zum quantitativen Nachweis von Antikörper- sezernierenden Zellen aus Blutproben von Patienten, und damit zur Bestimmung des Risikos einer fetalen Hirnblutung bei Schwangeren mit FNAIT, geeignet ist.MethodenIn dieser Studie wurde ein neuer B-Zell-ELISpot-Assay zur Detektion von Antikörpern gegen beta3-Integrine etabliert. Dies geschah in zwei Phasen. In Erster wurde ein ELISpot- Assay zur Testung monoklonaler Antikörper etabliert um die Sensitivität, Spezifität und Verbund-Abhängigkeit gegen beta3-Integrine zu charakterisieren. Hierfür wurden von Hybridom-Zellen sezernierte monoklonale Antikörper mittels auf einer Polyvinylidenfluorid -Membran (PVDF) fixierten Ziege-Anti-Maus-Antikörpern (GAM) gefangen. Anschließend wurden, die so immobilisierten Antikörper, mit den biotinylierten rekombinanten Integrinen alphaIIb beta3 und alphaV beta3 inkubiert. Zum Nachweis einer Antigenbindung wurde ein enzymmarkiertes Streptavidin-Substrat-System genutzt, dass eine Bindung in Form von Spots auf der Membran visualisierte. Drei Hybridomzelllinien: Gi5, Gi16 und AP3, die vorangehenden Untersuchungen als Anti- alphaIIbbeta3, Anti-alphaIIb und Anti-beta3 charakterisiert worden sind, wurden im ELISpot getestet. Als Negativkontrolle wurde eine Hybridomzelllinie (7D8) verwendet, die einen monoklonalen Antinkörper gegen CD177 produziert. In der zweiten Phase wurde dieser Assay für die Testung humaner B-Zellen weiterentwickelt. Der Aufbau des Assays blieb gleich, es wurden zur Immobilisierung sezernierter Antikörper Ziege-Anti-Human- Antikörper (GAH) verwendet. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von NAIT und GT-Patienten wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Diese wurden für 72 Stunden in eine Stimulationskultur mit Interleukin-2 (IL-2) und dem Toll- Like-Rezeptor-Agonisten (TLR) R848 übernommen. Nach Durchführung der in vitro Stimulation wurden die Zellen mit denselben rekombinanten Proteinen wie zuvor inkubiert. Der Nachweis der Antigenbindung erfolgte mit demselben Detektionssystem.ErgebnisseNach Etablierung des Assays für monoklonale Antikörper konnte eine Intra- von 4,28% und eine Inter-Assay-Variabilität von 6,38% gemessen werden. Anschließend wurden Untersuchungen zur Sensitivität und Spezifität durchgeführt. Im Vergleich mit der Positiv-Kontrolle (Total-IgG) konnte kein signifikanter Unterschied für die Detektion monoklonaler Antikörper gegen alphaIIbbeta3 und alphaVbeta3 (Antigenspezifisches-IgG) festgestellt werden, somit konnte jeder sezernierte Antikörper nachgewiesen werden. Weiterhin konnten in einem Grenzverdünnungsversuch bis zu 15 antikörpersezernierde Zellen (ASC) unter 985 Myelomzellen detektiert werden. Die Hybridomzelllinie AP3, die einen nicht Verbund-abhängigen Antikörper gegen die beta 3-Kette produziert, reagierte mit alphaIIbbeta3 und alphaVbeta3, wohingegen es bei Gi5, einem Verbund-abhängigen (compound- dependent) Antikörper, ausschließlich zur Spotbildung mit alphaIIbbeta3 kam. Die Analyse einer dritten Hybridomzelllinie, Gi16 (anti-alphaIIb), zeigte nur wenige Spots mit alphaIIbbeta3, was darauf hinwies, dass sich verschiedene Klone in der Kultur befanden (produzierende und nicht-produzierende). Nach erneuter Klonierung der Zelllinie durch die Grenzverdünnungsmethode konnte eine signifikant erhöhte Anzahl von Spots identifiziert werden. Für den Nachweis Antikörper-sezernierender Zellen aus Blutproben von Patienten war der Assay nicht geeignet. Wir vermuten, dass unspezifische Spots durch Zell-Aggregate zwischen Antigen-präsentierenden Zellen und exogen stimulierten B-Zellen hervorgerufen wurden.SchlussfolgerungIm Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt, werden, dass der hier entwickelte B- Zell-ELISpot-Assay zum Nachweis einzelner Antikörper-sezernierender Hybridomzellen in situ geeignet ist. Der Nachweis der Antikörper-Sekretion einzelner Hybridomzellen erlaubte Rückschlüsse auf die Klonalität und Produktivität der untersuchten Zelllinien. Ferner konnte in dem etablierten B-Zell-ELISpot-Assay in situ differenziert werden, ob monoklonale Antikörper die beta3-Integrin-Kette im Verbund mit einer jeweils spezifischen alpha-Kette oder Verbund-unabhängig erkennen. Zusammenfassend gesagt, ist der B-Zell-ELISpot ein geeignetes Verfahren, monoklonale Antikörper gegen beta3-Integrine in einem frühen Stadium nach Fusion zu charakterisieren.Damit wurde eine Grundlage für die Charakterisierung humaner monoklonaler Antikörper gelegt, mit denen die Pathogenese der Hirnblutung weiter aufgeklärt werden kann und neue Medikamente zur Prophylaxe von Blutungen entwickelt werden können.

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