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Molekulare Mechanismen der Wirkung der leberspezifischen microRNA-122 auf die Translation der Hepatitis C Virus-RNA

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2010

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10166

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Mechanismus der Stimulation der Translation der Hepatitis C Virus-RNA durch die leberspezifische microRNA-122 in humanen Zelllinien sowie in dem in vitro Translationssystem Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (RRL) untersucht.Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein Positivstrang-RNA-Virus der Familie Flaviviridae, das bevorzugt in humanen Leberzellen repliziert. Ein früher Schritt im Vermehrungszyklus des HCV ist die Translation des viralen RNA-Genoms. Die Initiation der Translation der HCV-RNA erfolgt unabhängig von einem Cap-Nukleotid an einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) in der 5´-nicht-translatierten Region (5´-NTR) des Virus-Genoms. microRNAs sind einzelsträngige nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden, die gewebespezifisch exprimiert werden. Als Bestandteil von microRNA-Protein-Komplexen (miRNP-Komplexen) fungieren sie hauptsächlich als Regulatoren der posttranskriptionellen Genexpression. Die Regulation der Translation erfolgt im Allgemeinen durch Interaktion der microRNA mit Ziel-Sequenzen in der 3´-NTR der mRNA, was zu einer Repression der Protein-Synthese führt. Dagegen stimuliert die leberspezifische microRNA-122 (miR-122) die IRES-vermittelte Translation einer HCV-Reporter-RNA in humanen Zelllinien.In dieser Arbeit wurde die biologische Relevanz der Stimulation der HCV-Translation durch miR-122 durch Studien mit vollständiger genomischer HCV-RNA in humanen Hepatoma-Zellen bestätigt. Weiterhin wurde gezeigt, dass die HCV-Translation auch im nicht-hepatozellulären in vitro Translationssystem RRL durch Zugabe von reifer miR-122 gefördert wird. Die Stimulation der HCV-Translation wird in RRL wie in humanen Zellen durch Interaktion der miR-122 mit Ziel-Sequenzen in der 5´-NTR der viralen RNA vermittelt. Weitere Analysen ergaben, dass die Stimulation der HCV-Translation durch miR-122 in vitro und in lebenden Zellen auf unterschiedlichen Wirkmechanismen beruht. Die Translationsstimulation in RRL erfolgt im Stadium der Initiation. Eine verstärkte Basenpaarung einzelsträngiger miR-122 mit der HCV-5´-NTR führt zur Blockierung einer inhibitorischen RNA-RNA-Interaktion zwischen Sequenzabschnitten der Protein-kodierenden Region und der 5´-NTR der HCV-RNA, was die Effizienz der Translation steigert. miR-122-assoziierte Proteine spielen dabei in RRL eine untergeordnete Rolle, da auch die Hybridisierung anderer einzelsträngiger RNA-Oligonukleotide verschiedener Länge mit der HCV-5´-NTR die Translation fördert. Die Stimulation der HCV-Translation in lebenden Zellen erfolgt dagegen unabhängig von der Ausbildung der inhibitorischen RNA-RNA-Interaktion und erfordert die Transfektion von doppelsträngigen Vorläufern der miR-122 mit exakter Länge, während einzelsträngige microRNAs keine translationsfördernde Wirkung haben. Die Resultate der vorliegenden Arbeit weisen auf eine Beteiligung von miR-122-assoziierten Proteinen in miRNP-Komplexen bei der Stimulation der HCV-Translation in lebenden Zellen hin und zeigen, dass die weitere Untersuchung des Einflusses der miR-122 auf die HCV-Translation in intakten Zellen erfolgen sollte.

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