Molekulare Charakterisierung neuartiger Biokatalysatoren aus Basidiomyceten

Abstract

Basidiomyceten als die am höchsten entwickelten Pilze stellen aufgrund ihrer komplexen Ausstattung an intra- und extrazellulären Enzymen wertvolle Werkzeuge für die Lebensmittelbiotechnologie dar. Da das stark viskositätserhöhende beta-1,3-1,6-D-Glucan Cinerean die Herstellung von Säften und Weinen erschwert, wurden 29 Basidiomyceten in einem Screeningverfahren mit Cinerean als Induktor auf beta-Glucanaseaktivität untersucht. 19 von ihnen zeigten potentielle beta-Glucanaseaktivität, die mit Hilfe des für Endoaktivität spezifischen Substrats Laminarin azur (beta-1,3-1,6-D-Glucan kovalent verknüpft mit Remazol Brillantblau R) näher charakterisiert wurde.Kulturüberstände von Phanerochaete chrysosporium zeigten die höchste Endoaktivität gegenüber Laminarin azur. Bei einem pH-Optimum von 5,0 wurde ein Temperatur-Optimum von 63 °C bis 68 °C ermittelt. Im Kulturüberstand wurden nach isoelektrischer Fokussierung 2 Enzyme nachgewiesen, die Aktivität gegenüber Laminarin zeigten. Die jeweiligen isoelektrischen Punkte betrugen 6,7 und 5,5. Die Analyse der Laminarinabbauprodukte mittels Größenausschlusschromatographie, gekoppelt mit einem Verdampfungslichtstreudetektor (SEC-ELSD), wies auf eine Endoaktivität hin. Mit Hilfe der Gelfiltrationschromatographie wurde eine Endo-beta-Glucanase mit einem Molekulargewicht von 39 kDa (GFC) bzw. 42 kDa (denaturierende SDS-PAGE) bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt und nach tryptischem Verdau mittels ESI-MS/MS de novo ansequenziert. Die erhaltenen Peptidsequenzen zeigten hohe Homologien zu einer Endo-1,3(4)-beta-Glucanase aus Phanerochaete chrysosporium.Basierend auf den ermittelten Peptidsequenzen wurde die für die Endo-beta-Glucanase kodierende cDNA mit 948 bp kloniert. Nach Anpassung der Nukleotidsequenz an die Codon Usage von E. coli wurde die Endo-beta-Glucanase heterolog exprimiert und mittels Western Blot nachgewiesen. Aus dem Basidiomyceten Pleurotus sapidus wurde die kodierende cDNA einer Oxygenase, die (+)-Valencen zu (+)-Nootkaton zu transformieren vermag, mit 1.191 bp kloniert. Die cDNA-Sequenz zeigte eine hohe Homologie zu einer mutmaßlichen Lipoxygenase aus dem nah verwandten Pilz Pleurotus ostreatus. Für die heterologe Expression der Oxygenase wurde die Nukleotidsequenz an die Codon Usage von Hansenula polymorpha angepasst. Die Expression wurde mittels Western Blot und oxygenasespezifischen Antikörpern nachgewiesen. Sowohl gegenüber (+)-Valencen als auch gegenüber dem für Lipoxygenasen typischen Substrat Linolsäure zeigte das rekombinante Enzym keine Aktivität. Due to their complex arsenal of intra- and extracellular enzymes, fungi of the class of basidiomycetes represent promising tools for applications in food biotechnology. The production of juices and wine may be hindered by the presence of the highly viscous beta-1,3-1,6-D-glucan cinerean. Therefore, 29 basidiomycetes were screened for beta-glucanase activity using cinerean as an elicitor. 19 of them showed beta-glucanase activity which were examined more closely with laminarin azure (beta-1,3-1,6-D-glucan covalently linked with Remazol Brilliant Blue R), a specific substrate for endo-activity.Culture supernatants from Phanerochaete chrysosporium showed highest endo-activity against the chemically modified beta-1,3-1,6-D-glucan laminarin azure. Optimal hydrolysis was observed at a pH value of 5.0 and temperature between 63 °C and 68 °C. Isoelectric focusing revealed 2 active enzymes with isoelectric points of 6.7 and 5.5, respectively. Analysis of the laminarin cleavage products by means of size exclusion chromatography coupled with an evaporative light scattering detector (SEC-ELSD) indicated an endo-activity of the enzyme. The molecular weight of an endo-beta-glucanase was determined to be 39 kDa (SEC) and 42 kDa (SDS-PAGE), respectively. The enzyme was purified to electrophoretic homogeneity by gel filtration chromatography (GFC). Peptide sequences obtained by ESI-MS/MS after tryptic digestion revealed high homologies to further endo-1,3(4)-beta-glucanase from Phanerochaete chrysosporium.The 948 bp cDNA of the endo-beta-glucanase was amplified by PCR and cloned. The nucleotide sequence was adapted to the codon usage of E. coli. The endo-beta-glucanase was heterologously expressed and successful expression was shown by western blot analysis.From the basidiomycete Pleurotus sapidus the 1191 bp-cDNA of an oxygenase, which oxidizes (+)-valencene to the grapefruit flavor (+) nootkatone, was cloned. The cDNA sequence showed high homology to a putative lipoxygenase to the closely related fungi Pleurotus ostreatus. The nucleotide sequence was adapted to the codon usage of Hansenula polymorpha, and the oxygenase was heterologously expressed. Successful expression was shown by western blot analysis. However, enzymatic activity for the oxidation of (+)-valencene was not detected.