Optimierte HPLC-Analytik zur Bestimmung der Bioverfügbarkeit von freiem und gebundenem Vitamin B6 in physiologischen Konzentrationen beim Menschen

Abstract

Zur Untersuchung der Bioverfügbarkeit von Vitamin B6 ist eine exakte Quantifizierung von sehr niedrigen Konzentrationen der Vitamere in verschiedenenMatrices (z.B. Lebensmittel, Plasma, Urin) erforderlich. Bislang standen zwar einzelne gute HPLC-Methoden für bestimmte UntersuchungsmaterialienVerfügung. Aufgrund der unterschiedlichen Spezifitäten, z.B. erfasstes Vitamerspektrum, jedoch ist ein Vergleich der so gewonnen Daten schwierig und mitnicht abschätzbaren Fehlern behaftet. Bei vielen HPLC-Techniken ist ausserdem häufig eine sehr aufwändige Nachsäulenderivatisierung erforderlich. Untersuchungsmethoden In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von einer modernen matrixspezifischen Methodik mit online-Derivatisierung die analytischen Verfahren soweitmodifiziert und verbessert, dass sehr gute Qualitätsparameter, z.B. Wiederfindungsrate, Präzision, Analysendauer) in verschiedenen Matrices erreicht wurden.In einem weiteren Schritt wurde die Analytik ergänzt, um neben den überwiegenden freien Formen auch gebundenes Pyridoxin, speziellPyridoxin-beta-Glucosid, quantifizieren zu können. Die neue Methode wurde in insgesamt 6 Testreihen mit bis zu 12 freiwilligen, gesunden Probanden einer praktischen Prüfung unterzogen. In den Testreihen 1und 2 wurden als Testmahlzeiten Blumenkohlportionen mit einem Vitamin B6-Gehalt in physiologischer Grössenordung verzehrt. Die jeweiligeVitamin B6-Menge war in beiden Testreihen jeweils gleich. In Testreihe 1 wurde Tiefkühl-Blumenkohl mit hohem Gehalt an Pyridoxin-Glucosid eingesetzt,während in Testreihe 2 marktfrischer Blumenkohl mit deutlichen niedrigerem Glucosid-Anteil verwendet wurde. In Testreihen 3 und 4 wurden Bezugswerte zurrelativen Bioverfügbarkeit mit Pyridoxin-Reinsubstanz als p.o.-Applikation gesammelt. In Testreihe 5 verzehrten die Probanden Karottensaft mit Mark, beidem der Anteil der Glucoside am Vitamin B6-Gehalt von 1,5 mg zwischen den Werten aus den Testreihen 1 und 2 lag. Testreihe 6 bestand abschliessend alsBezugsgrösse zur absoluten Bioverfügbarkeit aus einer i.v.-Applikation von Pyridoxin-Reinsalz in Höhe der Referenzwerte für die Zufuhr. Ergebnisse der Untersuchung Durch Vereinheitlichung der Probenaufbereitung konnten quantitative Daten, z.B. aus dem Plasma und einer Testmahlzeit, direkt miteinander verglichen werden,ohne dass längere Berechnungen zur Probenaufbereitung erforderlich waren. Gleichzeitig konnte die zur Vitamin B6-Quantifizierung notwendigeBlutentnahmemenge gesenkt werden. Die ausgearbeitete RP-HPLC-Technik mit Fluoreszenz-Detektion und online-Derivatisierung ermöglicht es, in einemAnalysengang die fünf bedeutenden Vitamere des Vitamin B6 sowie den Metaboliten Pyridoxinsäure zu quantifizieren. Die besondere Eignung dieser Methodezeigte sich bei den physiologischen Konzentrationen, welche wesentlich unterhalb des Bereiches lagen, der von bisherigen Versuchen, universell einsetzbareHPLC-Methode zu etablieren, berücksichtigt wurde. Hierbei zeigte sich eine indirekte Bestimmung durch enzymatische Freisetzung des gebundenen Pyridoxinsals sehr geeignetes Verfahren. Die Auswertung der Testreihen erfolgte anhand von nüchternwertbereinigten Plasmakonzentrationen bei Anwendung eines biokinetischenZwei-Kompartiment-Modelles sowie der Netto-Exkretion. Die Ergebnisse belegen die Leistungsfähigkeit der bereitgestellten analytischen Verfahrens. Mitausgewählten biokinetischen Auswertungen konnte eine gute Basis für weiterführende Untersuchungen gelegt werden. Dabei wurde ein umgekehrtproportionaler Zusammenhang zwischen dem Anteil an PN-Glucosiden einer Testmahlzeit und der Bioverfügbarkeit des totalen Vitamin B6. sowohl anhand derPlasmakurven als auch den Urinexkretion gezeigt. Neben den Werten zur Bioverfügbarkeit betreffen weitere Ergebnisse zur Biokinetik die Absorption vonPyridoxin. So ergaben sich nach p.o.-Aufnahme von Pyridoxin-Reinsubstanz niedrigere Flächen unter den Plasmakurven als nach Verzehr von Karottensaftgleichen Vitamingehaltes.