Morphologische Analyse der caninen Netzhaut bei RPE65-Mangel mit und ohne gentherapeutischer Intervention

Abstract

Hereditäre Netzhautdystrophien wie die Lebersche kongenitale Amaurose und die frühkindliche Netzhautdegeneration führen zu einer Dysfunktion und Degeneration der Photorezeptoren und des retinalen Pigmentepithels der Retina. Dies zeigt sich unter anderem als schwerwiegende Visusminderung in den ersten Lebensmonaten, die im weiteren Verlauf zur Erblindung führt. Eine Mutation des RPE65-Gens macht 5-10 % aller Erkrankungen aus. Das natürlich vorkommende Hundemodell des Briard Hundes mit RPE65-Mangel dient als passendes Tiermodell für die rekombinante adenoassoziierte (rAAV) Gentherapie. In mehreren caninen Studien konnten bereits Erfolge erzielt werden. Neben einer Funktionswiederherstellung ergab sich bei frühzeitgier Applikation die Möglichkeit der Strukturerhaltung der Retina über einen längeren Zeitraum. Im Gegensatz dazu konnte in den humanen Studien zwar eine Verbesserung des Visus und der Lichtempfindlichkeit festgestellt, jedoch die Degeneration nicht aufgehalten werden. Das Ziel dieser Arbeit war es mithilfe der Segmentierung einzelner Netzhautschichten von OCT-Aufnahmen und der histologischen und immunhistochemischen Untersuchung der Retinae der RPE65-/--Hunde den Erfolg der rAAV2/4-Gentherapie zu evaluieren. Die Studie umfasste die Retinae von drei erkrankten Hunden und eines heterozygoten Wildtyps. Die erkrankten Hunde erhielten auf dem jeweils rechten Auge eine subretinale Injektion des Vektors, während das linke unbehandelte Auge als Kontrolle diente. Die Ergebnisse wurden denen des gesunden Kontrolltieres gegenübergestellt. Die Segmentierung der Retina erfolgte mit DiOCTA und die immunhistochemische Untersuchung erfolgte mit Antikörpern gegen RPE65 und GFAP. Die Auswertung der ONL+ Schicht ergab eine Tendenz zur geringeren Schichtdickenabnahme nach Therapie. Somit wurde die Degeneration in den behandelten Retinae verlangsamt, wobei sich jedoch der Zusammenhang nicht als statistisch signifikant erwies. Die Segmentierung der ISe+ und der gesamten Retina lieferten keine aussagekräftigen Ergebnisse, vermutlich aufgrund des Tapetum lucidums, welches in diese Schichten miteinbezogen wurde. In der immunhistochemischen Untersuchung konnte im gesamten transduzierten Bereich der behandelten Augen RPE65 nachgewiesen werden, während in unbehandelten Augen keine Expression von RPE65 zu finden war. Zusätzlich konnte in dem transduzierten Bereich eine eindeutig definierte und damit besser erhaltene ISe ausgemacht werden. Die HE-gefärbten Paraffin- und Kryostatschnitte zeigten die stark verringerte Schichtdicke der ONL der erkrankten Tiere im Vergleich zu dem Kontrolltier. Durch die Nebeneinanderstellung von OCT-, HE- und immunhistochemischer Aufnahmen konnte das Krankheitsbild umfassend beurteilt werden.