Entwicklung von Replikonsystemen mit subgenomischen Abschnitten von HCV-RNA Genotyp 3a Isolaten klinisch charakterisierter Patienten

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2007

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-12190

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Das Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt eine RNA mit positiver Orientierung. Das Genom enthält ca. 9600 Nukleotide, die für ein einziges Polyprotein mit einer Länge von ca. 3000 AS kodieren. An beiden Seiten des Genoms befindet sich jeweils eine nicht-translatierte Region (5 NTR, 3 NTR). Das Polyprotein wird co-und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in mindestens 10 Proteine gespalten. Lange Zeit stand kein geeignetes Zellkultursystem mit replizierender HCV-RNA zur Verfügung. Das vor einigen Jahren entwickelte Replikationsmodell mit replizierenden subgenomischen Abschnitten von HCV-RNA des Genotyps 1b ermöglicht neben der Untersuchung des viralen Replikationszyklus und der Proteinexpression die Austestung von antiviralen Substanzen. Nachfolgend wurden Isolate weiterer Genotypen (1a/b, 2a) beschrieben, die in Zellkultur erfolgreich replizieren. Mit Ausnahme des HCV-Genotyps 2a steht für die entwickelten Replikonsysteme keine Information der jeweiligen HCV Isolate bezüglich Resistenz bzw. Sensitivität gegenüber einer IFN basierten Therapie im Patienten zu Verfügung. Ein System mit replizierender subgenomischer HCV-RNA des Genotyps 3a wurde bis dato nicht beschrieben. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von Replikonkonstrukten von HCV-Isolaten des Genotyps 3a. Für die Herstellung dieser Replikonkonstrukte wurden Isolate ausgewählt, die unterschiedlich auf die Therapie angesprochen hatten, was im späteren Verlauf vergleichende Untersuchungen bei der Erforschung von Resistenzmechanismen der einzelnen HCV Isolate ermöglichen sollte. Im ersten Schritt erfolgte die Amplifikation des gesamten Genomabschnittes, der für die Nichtstrukturproteine NS3-NS5B kodiert. Nach Analyse der Aminosäuresequenz der Proteine NS3-NS5B von vier Klonen wurden von beiden Isolaten die entsprechenden Konsensusklone generiert, auf deren Basis RNA-Replikonkonstrukte hergestellt wurden. Zusätzlich erfolgte die Generierung von Replikonkonstrukten, die eine Mutation in den einzelnen NS-Genen NS3, NS4B, NS5A enthielten, die bereits bei anderen in Zellkultur replizierenden Isolaten als adaptiv beschrieben worden waren. Zudem wurden Replikonkonstrukte hergestellt, die neben den Nichtstrukturproteinen die 3 NTR eines Genotyp 3a-Isolates enthielten. Es erfolgte die Transfektion von naiven HuH-7 Zellen sowie einer adaptierten Zellinie (HuH-7.5) mit den in dieser Arbeit hergestellten Replikonkonstrukten. Parallel wurden HuH-7 Zellen mit dem bereits etablierten Replikonkonstrukt vom Genotyp 1b transfiziert. Nach Transfektion der Zellen mit den in dieser Arbeit hergestellten Replikonkonstrukten konnten unter G418 keine Zellen selektioniert werden, in denen HCV-RNA des Genotyps 3a erfolgreich replizierte. Zusammenfassend konnte der Versuch ein HCV-Replikonsystem mit replizierenden subgenomischen Abschnitten des Genotyps 3a zu etablieren, nicht erfolgreich abgeschlossen werden.

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