Entwicklung und Prüfung eines Impfstoffes gegen die Ödemkrankheit der Schweine
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Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Toxoidimpfstoffe gegen die Ödemkrankheit derSchweine auf der Basis von rekombinantem Shigatoxin vom Typ 2e (rStx2e) zu entwickelnund ihre Wirksamkeit an Ferkeln zu prüfen.Die Stx2e-Gene stxA2e und stxB2e des E. coli-Stammes 412 wurden in den PlasmidvektorpET-24b(+) inseriert und in kompetenten E. coli BLR(DE3)-Zellen kloniert. Die Identität allerrStx2e-Transformanten bzw. die ordnungsgemäße Klonierung und Expression der Stx2e-Gene wurde mit Hilfe von PCR, Sequenzierung, Tricine-SDS-PAGE, Immunoblot und Verozell-Zytotoxizitätstest überprüft. Für die Wirksamkeitsprüfung von Impfstoffen wurde einstandardisiertes und kontrolliertes Ödemkrankheitsmodell etabliert, bei dem rStx2eintravenös an sechs Wochen alte Ferkel verabreicht wurde. In Abhängigkeit von der Dosistraten nach wenigen Stunden typische Symptome der Ödemkrankheit auf (Unterhautschwellungenan Augenlidern und Nasenrücken, Ataxien, Krämpfe, Festliegen, Ruderbewegungen,Todesfälle). In Anlehnung an die Europäische Pharmakopöe wurde die Belastungsdosisauf 750.000 CD50 pro Ferkel eingestellt (mind. 40 % Mortalität und 85 % Morbidität).Zur Verwendung als Impfantigen wurde rStx2e chemisch inaktiviert, indem es mit GlutaroderFormaldehyd behandelt wurde (rStx2eGA und rStx2eFA). In einem alternativen Ansatzwurden auf gentechnischem Wege rStx2e-Varianten erzeugt, in denen eine, zwei oder dreibestimmte Aminosäuren in der A-Untereinheit des Toxins (E167Q, R170L, A216D)substituiert worden waren. Die Aldehydbehandlungen reduzierten die toxische Aktivität desrStx2e gegenüber Verozellen um den Faktor 1.000 - 2.000, verminderten aber auch dieErkennung des Antigens durch Antikörper im ELISA. Die gentechnisch hergestellte VarianterStx2eE167QR170L war um den Faktor 132.278 weniger toxisch als unverändertes rStx2e. Diegenetisch veränderten rStx2e-Varianten wurden von den entsprechenden E. coli BLR(DE3)-Stämmen stärker exprimiert als unverändertes Stx2e.Zur Überprüfung ihrer Immunogenität wurden die rStx2e-Impfantigene mit verschiedenenAdjuvantien (Aluminiumhydroxid, Montanide) vermischt und an den Lebenstagen 9 und 28intramuskulär an Saugferkel verimpft. Placebo-geimpfte und nicht geimpfte Ferkel dientenals Kontrollen. Einige Tage nach dem Absetzen (Lebenstag 37 oder 38) wurden alle Ferkelintravenös mit rStx2e belastet. Vor und nach der Impfung sowie nach der Belastung wurdenSerumproben genommen und auf E. coli-spezifische Antikörper (ELISArStx2e) sowie rStx2eneutralisierendeAntikörper (Stx2e-Neutralisationstest) untersucht.Alle getesteten Toxoidimpfstoffe wirkten protektiv, was sich an der im Vergleich zur Kontrollgruppegeringeren Mortalität in den Impfgruppen äußerte. Von dem mit rStx2eGA-Antigengeimpften Ferkeln (Antigendosis & #8805; 750.000 CD50-Äquivalente) überlebten 98 % die rStx2e-Belastung. Bei Impfung mit 150.000 CD50-Äquivalenten überlebten noch 83,4 %, bei15.000 CD50-Äquivalenten nur 28,6 %. Mit einer Dosis von 1.500 CD50-Äquivalenten war keinFerkel zu schützen. Von den Ferkeln, die mit Toxoidimpfstoffen auf Basis von rStx2eE167QR170Lgeimpft worden waren, überlebten 82 % die rStx2e-Belastung, wobei die Mortalitäten in deneinzelnen Gruppen je nach eingesetztem Adjuvans deutlich differierten. So überlebten beiVerwendung der Montanide IMS1313 und IMS251C alle Ferkel, dagegen bei Aluminiumhydroxidnur 60 % der Ferkel.Nach der ersten Immunisierung waren Stx2e-neutralisierende Antikörper nur bei drei(rStx2eGA) der insgesamt 160 mit rStx2eGA- bzw. rStx2eE167QR170L-Toxoidvakzinen geimpftenFerkel (1,9 %) nachweisbar, nach der zweiten Immunisierung dagegen bei 80 % der Ferkel.Bei 92 % der geimpften Ferkel, welche die rStx2e-Belastung überlebten, waren vor derBelastung Stx2e-neutralisierende Antikörper vorhanden gewesen. Alle Ferkel mit einem Titervon >= 10 StdNT % überlebten die rStx2e-Belastung. Die höchsten Titer an Stx2e-neutralisierendenAntikörpern wurden mit dem rStx2eGA-Impfstoff in einer Antigendosis von1,5 oder 0,75 Mio CD50-Äquivalenten sowie dem rStx2eE167QR170L-Impfstoff in Kombination mitIMS1313 und IMS251C als Adjuvans erzielt. Bei den Kontrollferkeln waren Stx2eneutralisierendeAntikörper vor der rStx2e-Belastung in keinem einzigen Fall nachweisbar.Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass sowohl die chemisch als auch die gentechnischinaktivierten rStx2e-Impfantigene im Ferkel eine sehr gute immunogene und protektiveWirkung haben und sich daher zur Herstellung von Toxoidvakzinen gegen dieÖdemkrankheit eignen. Um eine hohe Schutzwirkung zu erzielen, ist eine zweimaligeImmunisierung mit einer minimalen Impfantigendosis von jeweils 750.000 CD50-Äquivalenten(rStx2eGA-Antigen) bzw. 15.750 OD50 (rStx2eE167QR170L-Antigen) erforderlich. Das Ödemkrankheitsmodell ist zur Wirksamkeitsprüfung von Stx2e-Toxoidimpfstoffen sehr gut geeignet, es ist aber auch aufwändig und mit Leiden für die Tiere verbunden. Die Quantifizierung von Stx2e-neutralisierenden Antikörpern kann entsprechende Versuche zumindest in einigen Fällen ersetzen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Lauferswweiler