Wechselwirkung von normoxischen und anoxischen Kardiomyozyten mit polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten

Abstract

The pathophysiological significance of free radicals after reperfusion of ischemic myocardium is still debated. Therefore, experiments were carried out with adultisolated cardiac myocytes in direct contact with stimulated neutrophils (ratio of neutrophils/myocytes: 10/1). Rat cardiac myocytes were isolated byLangendorff - perfusion with collagenase. Three different groups of myocytes were investigated: normoxic, 2h and 12h in anoxic conditions. Neutrophils wereisolated from rat blood by Percoll-gradient-centrifugation. The neutrophils were stimulated with N-formyl Met-Leu-Phe (fMLP), phorbolmyrestatacetate(PMA) and zymosan (Z). The formation of oxygen free radicals was detected as a bioluminescence signal mediated by luminol. The kinetics of the free radicalburst (FRB) resulted in an early maximum for fMLP stimulated neutrophils (20 sec) and for maxima at 5 min (PMA) and 20 min (Z). The FRB was depressedin the presence of normoxic myocytes compraed to controls (neutrophils alone) by 45% (fMLP stimulation), 30% (PMA) and 22% (Z). In contrast the signalincreases in the presence of 2h anoxic myocytes by 12% (fMLP), 81% (PMA) and 6% (Z). In the presence of 12h anoxic myocytes the FRB increases furtherto 918% (fMLP), 576% (PMA) and 198% (Z) compared to controls. Normoxic myocytes are not attacked by activated neutrophils, while the FRB increasesin presence of anoxic myocytes proportional to their ischemic insult. In conclusion, free radicals may be harmful after reoxygenation only to already severelydamaged myocardial cells.

Rattenmyozyten werden durch Perfusion mit Kollagenaselösung imLangendorffmodell isoliert. Die Myozyten werden 2h bzw. 12h anoxisch inkubiert.Eine 90% reine PMN-Fraktion wird aus Rattenblut durch Leukozytenauftrennung imDichtegradienten gewonnen. Durch unterschiedliche Stimuli wird der oxidativeburst der PMN erzeugt und die freie Radikalbildung im Auto-Lumat LB 953 alsBiolumineszenzsignal detektiert. PMN werden durch N-formyl Met-Leu-Phe (fMLP)mit seinem Maximum der freien Radikalbildung in den ersten 20 Sekunden, Phorbolmyristatazetat (PMA) und Zymosan (Zym) mit ihren Maxima bei 5 bzw.20 Minuten aktiviert. Der respiratory burst der stimulierten polymorphkernigenNeutrophilen ist in Anwesenheit von normoxischen Myozyten abgeschwächt. DasSignal erhöht sich in Anwesenheit von 2h bzw. 12h anoxischen Myozyten im Vergleichzu normoxischen deutlich bzw. massiv. Normoxische Herzmuskelzellen werden nichtdurch gebildete Sauerstoffradikale aktivierter PMN attackiert und überstehen die Co-Inkubation in der Zellkultur entsprechend gut, während bei anoxischenKardiomyozyten die freie Radikalbildung mit der Anoxiedauer korreliert. DieÜberlebenszeit der anoxischen Kardiomyozyten in der Co-Kultur mit aktiviertenPMN nimmt abhängig von der Anoxiedauer der Myozyten drastisch ab. Mit einemSOD-Inhibitor vorbehandelte normoxische Myozyten verlieren ihre Fähigkeit dieRadikale abzupuffern und sterben viel eher in der Co-Kultur ab im Vergleich zunormoxischen Myozyten ohne Präinkubation. Damit nähern sie sich in ihremVerhalten während der Radikalmessung von aktivierten PMN dem der anoxischenMyozyten an, wobei sie aber nicht ganz die Sauerstoffradikalbildung der anoxischenMyozyten erreichen. Neben dem SOD-System der Myozyten spielen aberwahrscheinlich Oberflächenveränderungen während der Anoxie eine zusätzlicheRolle. Durch Neuraminidase vorbehandelte Myozyten erzeugen einen Anstieg derRadikalproduktion und damit einen gesteigerten respiratory burst der aktiviertenPMN. Die aus den Experimenten gewonnenen Messergebnisse desBiolumineszenzassays und die Beobachtungen aus der Zellkultur weisen daraufhin,daß einerseits das endogene Radikalfängersystem der Myozyten Schaden nimmt, sodaß die gebildeten Radikale nicht mehr eliminiert werden können, bevor sieZellschäden verursachen können, und andererseits auch die verändertenOberflächenstrukturen der Myozyten die aktivierten PMN zu einer höherenRadikalproduktion anregen. Beide Komponenten bewirken dann unter anderem diekurze Überlebenszeit der anoxischen Myozyten im Kontakt mit aktivierten PMN.Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß bei der Reperfusion und Reoxygenierung desMyokards, mit dem Blut PMN eingeschwemmt werden, welche nach Aktivierung imGewebe die reversibel geschädigten, ischämischen Myozyten durch die Produktionvon freien Sauerstoffradikalen schädigen können.