Comparative studies of recombinant oncolytic viruses for the treatment of CD133-positive tumors

Abstract

Cancer stem cells (CSCs) have been found to mark the tumorigenic cell population within various malignancies. Among many putative markers, prominin-1 (also known as CD133) is frequently used to identify and isolate CSCs of the above mentioned malignancies. To date, there is no effective approach to reduce the rate of tumor recurrence ascribed to CSCs. Thus, targeting of CSCs is critical to achieve long-term success in cancer treatment. One strategy to selectively destroy CSCs is the precise targeting of this cell subset via targeted oncolytic viruses (OVs). One of the lead oncolytic agents in ongoing clinical trials is oncolytic measles virus (MV) based on the safe vaccine strain Edmonston B (Edm) that induced complete remission after one intravenous (i.v.) administration of 1E+11 infectious virus in one patient suffering from disseminated multiple myeloma (Russell et al., 2014). MV-Edm uses the ubiquitous membrane cofactor protein (MCP, also known as CD46) for cell entry, which is overexpressed on tumor cells. To restrict virus replication to tumor cells, the glycoprotein (gp) complex of MV can be engineered to redirect receptor usage to cell surface proteins of choice. Based on this approach, a CD133-retargeted MV (MV-CD133) was generated prior to this work through fusion of a CD133-specific single-chain antibody fragment (scFv) as targeting domain to the receptor attachment protein hemagglutinin (H) ablated for its natural receptors CD46, signal lymphocyte-activation molecule (SLAM) and nectin-4 (also known as Poliovirus receptor-related 4, PVRL4). MV-CD133 exhibited a stronger oncolytic activity on CD133-positive tumors compared to untargeted parental MVs using CD46 for cell entry (Bach and Abel et al., 2013).As tumor regression was incomplete, this thesis pursued strategies to enhance the oncolytic activity of MV-CD133 without having to compromise on safety. For that purpose, arming with the prodrug 5-fluorocytosine (5-FC) converting suicide gene supercytosinedeaminase (SCD), or with P/V/C genes from wild-type MVs, or receptor extension through omission of blinding mutations were pursued. Additionally, a chimeric vesicular stomatitis / measles virus (VSV-MV), in which the gp VSV-G was replaced by the MV-H and MV-F gp fused to a CD133-scFv was examined. The viruses were analyzed for their oncolytic activity in vitro and by in vivo models of the hepatocellular carcinoma (HCC) cell line HuH7 and of the primary glioma sphere cells NCH644 using NOD/Scid (Nonobese diabetic/severe combined immunodefiency) mice known to be devoid of human CD46 expression. All viruses were found to be highly selective for CD133-positive cells as demonstrated by infection of receptor transgenic chinese hamster ovary (CHO) cells. As CD133 is also expressed on early hematopoietic progenitor cells, the proliferative and differentiation capacity of infected human hematopoietic stem cells (HSCs) was evaluated using clonal outgrowth assays. None of the CD133-retargeted viruses impaired the hematopoietic capabilities of HSCs. On HuH7 cells, VSV-MV chimeric viruses yielded substantially higher titers than their parental viruses. VSV-CD133 and MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) achieved the most rapid and efficient cytotoxicity on HuH7 cells. In a subcutaneous HuH7 model, VSV-CD133 most efficiently slowed down tumor growth resulting in a prolonged survival of mice treated intratumorally (i.t.) and i.v.. VSV-CD133 infected a more than 1E+04-fold larger area of the tumor than MV-CD133 did in the same period. In killing assays on NCH644 cells, all viruses killed cells dose-dependently. While MV-CD46/CD133 and MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) caused a continuous decline in cell numbers over time even at low multiplicity of infection (MOI), VSV-MV chimeric viruses were only able to reduce cell viability within in the first 48 h after infection. In an orthotopic NCH644 model, MV-CD46/CD133 and MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) were most effective in prolonging survival compared to mock-treated mice. Ex vivo sphere formation assays revealed that cells of those tumors explanted at termination showed impaired stemness properties compared to those of the other viruses. By contrast, VSV-CD133 led to severe neurotoxic symptoms within 10 days after infection in tumor bearing mice. The neurotoxicity was also apparent in tumor-naïve mice that were intracerebrally (i.c.) injected with VSV-CD133 as well as upon injection with nontargeted VSV-MV suggesting that deceased mice must have succumbed to another genesis than that of i.t. virus amplification or the scFv themselves. The role of the yet un-known neuronal MV receptor or a membrane fusion process that occurred independently from a contact with H need to be tested as potential causatives. Krebsstammzellen (engl. cancer stem cells, CSCs) definieren die tumorigene Zellpopulation in verschiedenen Tumoren. Ein vermeintlicher Marker für die Identifizerung und Isolierung von CSC ist Prominin-1 (auch bekannt als CD133). Bislang gibt es keinen wirksamen Ansatz, um die Tumorrezidiv-Rate, die den CSC zugeschrieben wird, zu senken. Daher ist die gezielte Zerstörung von CSC bedeutend für einen langfristigen Therapieerfolg. Eine Strategie zur selektiven Zerstörung von CSC ist das präzise targeting dieser Zellen mittels onkolytischer Viren (OVs). Eines der führenden OV in laufenden klinischen Studien ist ein onkolytisches Masernvirus (MV) auf der Grundlage des Impfstoffstammes Edmonston B (Edm), das nach einer intravenös (i.v.) verabreichten Dosis von 1E+11 infektiösen Einheiten eine vollständige Remission eines disseminierten multiplen Myeloms induzierte (Russell et al., 2014). MV-Edm nutzt das ubiquitäre CD46, das auf Tumorzellen überexprimiert wird, für den Zelleintritt. Um die Virusreplikation auf Tumorzellen zu begrenzen, kann der Glykoprotein-Komplex von MV so konstruiert werden, dass ein Zelloberflächenprotein der Wahl für den Zelleintritt verwendet wird. Basierend auf diesem Ansatz wurde zuvor durch Fusion eines CD133-spezifischen Einzelketten-Antikörperfragments (scFvs) als Targeting-Domäne an das Rezeptor-bindende Hämagglutinin (H) ein CD133-spezifisches MV (MV-CD133) erzeugt, dessen natürliche Rezeptornutzung durch vier spezifische Punktmutationen unterbunden wurde. MV-CD133 zeigte eine stärkere onkolytische Aktivität bei CD133-positiven Tumoren im Vergleich zu ungezielten MV, die CD46 für den Zelleintritt verwenden (Bach und Abel et al., 2013).Ziel der vorliegenden Arbeit war es ohne Einbußen an Sicherheit die onkolytischen Aktivität von MV-CD133 zu verbessern. Zu diesem Zweck wurde MV-CD133 mit dem induzierbaren zytotoxischen Transgen Super-Cytosindeaminase (SCD) oder mit dem P/V/C-Gen des MV Wildtyps ausgestattet. Zudem wurde durch Weglassen der blinding mutations ein CD133-spezifisches MV mit einer breiteren Rezeptorausnutzung entwickelt (MV-CD46/CD133). Zusätzlich wurde ein chimäres vesikuläres Stomatitis/Masernvirus (VSV-MV) untersucht, bei dem das VSV-Glykoprotein G durch die an CD133-scFv fusionierten MV-Glykoproteine ersetzt wurde. Die onkolytische Aktivität der Viren wurde auf der hepatozellulären Karzinom (HCC) Zelllinie HuH7 und den primären Gliomzellen NCH644 in vitro sowie in vivo unter Verwendung von NOD/Scid (Nonobese diabetic/severe combined immunodefiency) Mäusen analysiert, die keine humane CD46-Expression aufweisen. Alle Viren infizierten selektiv CD133-positive Zellen, was durch die Infektion von Rezeptor-transgenen chinesischen Hamster-Eierstockzellen (CHO) gezeigt wurde. Obwohl CD133 auch auf frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert wird, wurden die Stammzell-Eigenschaften infizierter humaner hämatopoetischer Stammzellen (engl. hematopoietic stem cells, HSCs) durch keines der CD133-spezifischen Viren beeinträchtigt. Auf HuH7 Zellen ließen sich mit den VSV-MV Hybridviren wesentlich höhere Titer als mit den jeweiligen parentalen Viren erzeugen, wobei VSV-CD133 und MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) die schnellste und effizienteste Zytolyse induzierten. In einem subkutanen HuH7-Modell verlangsamte VSV-CD133 das Tumorwachstum am effizientesten und führte zu einem verlängerten Überleben der Mäuse, die intratumoral (i.t.) bzw. i.v. therapiert wurden. VSV-CD133 infizierte eine 1E+04-fach größere Fläche des Tumors als MV-CD133 in demselben Zeitraum. Auf NCH644-Zellen töteten alle Viren die Zellen dosisabhängig ab. Während MV-CD46/CD133 und MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) selbst bei geringer multiplicity of infection (MOI) zu einem kontinuierlichen Rückgang der Zellzahlen im Laufe der Zeit führten, konnten VSV-MV Hybridviren die Zellvitalität nur innerhalb der ersten 48 Stunden nach Infektion reduzieren. In einem orthotopen NCH644 Modell führte die Infektion der Tumore mit jeweils MV-CD46/CD133 und MV-SCD-CD133 (+ 5-FC) zu den längsten Überlebenszeiten im Vergleich zu Kontroll-Mäusen (mock). Ex vivo sphere formation assays zeigten, dass explantierte Tumorzellen, die mit den o.g. Viren infiziert wurden, im Vergleich zu den Tumorzellen der restlichen Therapiegruppen ihre Stammzell-Eigenschaften verringert oder sogar verloren hatten. Im Gegensatz dazu führte VSV-CD133 innerhalb von 10 Tagen nach der Infektion bei tumortragenden Mäusen zu schweren neurotoxischen Symptomen. Die Neurotoxizität zeigte sich auch bei mit VSV-CD133 intracerebral (i.c.) injizierten nicht-Tumor tragenden Mäusen sowie bei der Injektion mit ungerichtetem VSV-MV, was darauf hindeutet, dass diese Mäuse aus anderen Gründen als eine i.t. Virusamplifikation oder eine scFv-vermittelte Toxizität eine gesteigerte Letalität aufwiesen. Die Rolle des noch unbekannten neuronalen MV-Rezeptors oder eines Hämagglutinin-unabhängigen Membranfusionsprozesses, müssen als mögliche Ursachen getestet werden.