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Transkriptspezifische Entkopplung von mRNA-Abbau, Translation und Assemblierung von processing bodies

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2018

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Entzündungsreaktionen sind durch rasche, starke und transiente Veränderungen der zellulären Genexpression gekennzeichnet, welche u.a. durch proinflammatorische Zytokine wie Interleukin-1 (IL-1) vermittelt werden. IL-1 beeinflusst dabei sowohl die Syntheserate, als auch den Abbau der messenger (m)RNA Moleküle. Die molekularen Mechanismen, welche die zeitlich koordinierte und dynamische Expression von hunderten von unterschiedlichen IL-1 Zielgenen auf diesen beiden Ebenen des mRNA-Stoffwechels orchestrieren, sind dabei noch unvollständig verstanden. Beim mRNA-Abbau stellt das Decapping einen zentralen, die mRNA Degradation einleitenden Prozess dar. Zunächst erfolgt hierbei die Hydrolyse der 5´-m7-Guanosin-Cap-Struktur durch die katalytische Untereinheit des Decapping-Komplexes DCP2, wonach die mRNA in 5´3´-Richtung durch die Exoribonuklease XRN1 abgebaut wird. DCP2 und XRN1 können dabei u.a. zusammen mit der regulatorischen Untereinheit des Decapping-Komplexes DCP1a und dem scaffold Protein EDC4 in membranlosen, zytoplasmatischen processing bodies (P-Bodies) kolokalisieren. Aufgrund dieser starken, lokalen Konzentration von Faktoren des mRNA-Abbaus besteht die Annahme, dass diese makromolekularen Strukturen präferentielle Kompartimente des mRNA-Abbaus darstellen. Eine alternative Hypothese impliziert P-Bodies als Orte der transienten Lagerung von mRNAs, die dem Translationsprozess vorübergehend entzogen worden sind. Ein übergeordnetes Ziel dieser Dissertation war es, die Relevanz von Decapping-Faktoren im proinflammatorischen signaling zu untersuchen. Dazu wurden im ersten Teil dieser Arbeit posttranslationale Modifikationen von Decapping-Faktoren sowie die dabei beteiligten Enzyme untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit von der IL-1-induzierten, reversiblen Phosphorylierung und K63-abhängigen Ubiquitinylierung von DCP1a durch JNK bzw. TRAF6 die Decapping-Aktivität, die Interaktion von einzelnen Decapping-Faktoren und die Assemblierung von P-Bodies reguliert werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zur weiteren Untersuchung der Rolle von Decapping-Faktoren und der dualen Funktion von P-Bodies DCP1a, EDC4 oder XRN1-defiziente Zelllinien mittels des CRISPR/Cas9 Systems etabliert. In diesen Modellsystemen zeigte sich nach der Depletion von EDC4 eine verringerte Phosphorylierung von DCP1a, sodass hier EDC4 eine neue Rolle bei der Rekrutierung der zuständigen DCP1a Kinase JNK spielt. Der knockdown von DCP1a zeigte dagegen eine weitreichende Reduzierung der IL-1-abhängigen Aktivierung von JNK und p38 MAPK, sowie eine Verringerung der NFkB p65 Translokalisation in den Zellkern, wodurch DCP1a als neue regulative Komponente im gesamten IL-1 signaling betrachtet werden kann. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Assemblierung von P-Bodies unmittelbar von der Proteinkonzentration der einzelnen Faktoren abhängig ist. Während die Depletion von DCP1a zu einer Erhöhung der zellulären P-Body-Anzahlen führte, hemmte der knockdown von EDC4 die P-Body-Assemblierung komplett. Die Depletion von XRN1 hingegen bewirkte eine Erhöhung der P-Body-Größe. Mikroskopische Kolokalisationsstudien unter Verwendung von proximity ligation assays zeigten, dass die Depletion von DCP1a, EDC4 oder XRN1 zu einer Reduktion der zytoplasmatischen Protein:Protein-Interaktionen dieser Faktoren außerhalb der P-Bodies führt. Diese Veränderungen der P-Body-Assemblierung nach der Depletion von DCP1a, EDC4 oder XRN1 korrelierten nicht mit einer Veränderung der mRNA-Spiegel der proinflammatorischen Transkripte IL8, IL6, CXCL3 und NFKBIA, so dass der Abbau dieser mRNAs offenbar überwiegend außerhalb von P-Bodies stattfindet. Alle drei knockdowns führten jedoch zu einer transkriptspezifischen Stabilisierung der untersuchten mRNAs. Dieser Effekt war für die NFKBIA mRNA nach der Depletion von XRN1 am stärksten ausgeprägt. Eine systematische Analyse der subzellulären Verteilung der IL8-, NFKBIA- und IL6- Transkripte mittels single molecule RNA-FISH zeigte eine massive Akkumulation der NFKBIA-mRNA, aber nicht der IL8-mRNA, in den P-Bodies der XRN1 knockdown Zellen. Zur Untersuchung der Fragestellung, ob diese Akkumulation der NFKBIA-Transkipte in den P-Bodies Auswirkungen auf den Proteinspiegel des zentralen NFkB-Regulators IkBa aufweist, wurden pharmakologische Inhibitoren der IL-1-Signaltransduktion, der Transkription und der Translation eingesetzt, um so mRNA-und Proteinmengen zu modulieren. Hierdurch konnte keine Auflösung der Akkumulation des NFKBIA-Transkriptes in den P-Bodies der XRN1 knockdown Zellen herbeigeführt werden und es fand sich keine Korrelation zwischen mRNA-Abbaurate, mRNA-Lokalisation und IkBa-Proteinspiegel. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen damit, dass Decapping-Faktoren im IL-1 Signalweg einerseits posttranslational reguliert werden, andereseits aber auch selbst einen Einfluss auf die IL-1 Signalkaskaden ausüben. Während DCP1a, EDC4 und XRN1 beim Abbau von IL-1-induzierten Transkripten beteiligt sind, ist die Assemblierung von P-Bodies dagegen für diesen Effekt nicht erforderlich. Unter Konditionen mit gehemmtem mRNA-Abbau ermöglicht die dynamische Umverteilung der mRNAs in P-Bodies die Konstanthaltung der zellulären Proteinmenge, indem die kumulierenden Transkripte nicht für die Translation im Zytoplasma zur Verfügung stehen. Somit zeigen diese Daten, dass P-Bodies im proinflammatorischen signaling vor allem als Speicherorte für mRNAs und mRNA-Abbaufaktoren fungieren und so direkt Einfluss auf die Genexpression bei einer Entzündungsreaktion nehmen können.


Inflammatory reactions are characterized by rapid and strong changes in the cellular expression of genes, a process that is mediated by proinflammatory cytokines such as interleukin-1 (IL-1). Thereby, IL-1 regulates both the rate of synthesis and decay of messenger (m)RNA molecules. The molecular mechanisms that orchestrate the timely and dynamic expression of hundreds of different IL-1 target genes at these two levels of the mRNA metabolism are incompletely understood. Decapping is a central process initiating mRNA degradation. After hydrolysis of the 5´-m7-guanosin-cap-structure by the catalytic subunit of the decapping complex, DCP2, the mRNA is degraded in 5´-3´ direction by the exoribonuclease XRN1. DCP2 and XRN1 colocalize together with the regulatory subunit of the decapping complex DCP1a and the scaffolding protein EDC4 within membrane-less cytoplasmic processing bodies (P-bodies). This strong local concentration of mRNA decapping factors has led to the hypothesis that these macromolecular structures are preferential sites of mRNA decay. An alternative hypothesis implicates P-bodies as transient sites of storage for mRNAs which have been withdrawn from translation. An overarching aim of this thesis was to explore the relevance of decapping factors for proinflammatory signaling. In the first part of this work posttranslational modifications of decapping factors and the enzymes involved were investigated. It was shown that reversible IL-1-induced phosphorylation by JNK and K63-linked ubiquitination by TRAF6 regulate decapping activity, interaction of decapping factors and P-body assembly. In the second part of the work, DCP1a, EDC4 and XRN1-deficient cell lines were established by the CRISPR/Cas9 system and used to investigate the roles of decapping factors and the dual function of P-bodies. In these models, the depletion of EDC4 resulted in reduced phosphorylation of DCP1a suggesting that EDC4 plays a new role recruiting the DCP1a kinase JNK. The knockdown of DCP1a resulted in suppression of IL-1-mediated activation of JNK and p38 MAPK and in reduced nuclear translocation of NFkB p65. Thus, DCP1a can be viewed as a new regulatory component of the IL-1 signaling pathway. Moreover, it was shown that the assembly of P-bodies is directly dependent on the concentration of the individual factors. Whereas depletion of DCP1a increases P-body numbers, knockdown of ECD4 completely impairs P-body assembly. In contrast, depletion of XRN1 increases P-body size. Microscopic colocalization studies using proximity ligation assays revealed that the depletion of DCP1a, EDC4, or XRN1 led to the reduction of protein:protein interactions of these factors outside of P-bodies. These changes in P-body assembly after depletion of DCP1a, EDC4 or XRN1 did not correlate with changes in mRNA levels of the proinflammatory transcripts IL8, IL6, CXCL3 and NFKBIA. Therefore, the decay of these mRNAs occurs mainly outside of P-bodies. However, all three knockdowns results in transcript-selective stabilization of the examined mRNAs. This effect was most prominent for the NFKBIA mRNA in cells lacking XRN1. A systematic analysis of the subcellular distribution of IL8, NFKBIA and IL6 transcripts by single molecule RNA-FISH revealed a massive accumulation of NFKBIA mRNA but not IL8 mRNA in P-bodies of XRN1 knockdown cells. This raised the question if the accumulation of NFKBIA transcripts within P-bodies affects the protein levels of the central regulator of NFkB, IkBa. Towards this end, pharmacological inhibitors of IL-1 signaling, transcription and translation were used to modulate mRNA and protein levels. In no instance a resolution of NFKBIA accumulation within P-bodies was observed and there was no correlation between mRNA decay rate, mRNA localization and IkBa protein level. Collectively, the results of this thesis show that within the IL-1 pathway decapping factors are regulated by posttranslational modifications but themselves also directly affect IL-1-signaling cascades. Whereas DCP1a, EDC4 and XRN1 participate in decay of IL-1-induced transcripts, the assembly of P-bodies is not needed for this effect. Under conditions of suppressed mRNA decay the dynamic redistribution of mRNAs into P-bodies facilitates maintenance of cellular protein levels by excluding cumulated transcripts from cytoplasmic translation. These data show that for proinflammatory signaling P-bodies function primarily as storage sites for mRNAs and mRNA decay factors thereby directly influencing gene expression during inflammation.

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