Expressionsanalyse Interferon-alpha-positiver und -negativer humaner plasmacytoider dendritischer Zellen

Abstract

Humane plasmacytoide dendritische Zellen (pDCs) übernehmen verschiedene Funktio-nen im Immunsystem, wie die Abwehr von Viren und die Aufrechterhaltung von peri-pherer und zentraler Toleranz. Sie sind in der Lage, das adaptive und erworbene Immunsystem zu verbinden. Die pDCs zeichnen sich durch ihr Haupt-Produkt das IFN-alpha aus. Dadurch erlangen sie die Möglichkeit, TH1-Immunantworten zu bewirken. Da ihre teilweise konträren Aufgaben im Immunsystem hierdurch alleine nicht erklärt werden können, stellt sich die Frage, ob die pDCs noch weitere Zytokine produzieren können und ob sie anhand dieser Fähigkeit in Subpopulationen unterteilt werden könn-ten.Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurden PBMCs aus Rest-Buffy Coats von ge-sunden jungen Spendern isoliert, mit einem Gemisch aus CpG-ODN 2216 (5 µg/ml), IL-3 (20 ng/ml) und Dotap (1 µg/µl) stimuliert und anschließend für fünf Stunden unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Im weiteren Verlauf wurden die pDCs mit einem Oberflächenmarker für IFN-alpha markiert und mit verschiedenen Antikörpern angefärbt, um die Population einzugrenzen. Hierfür wurden neben IFN-alpha, Lineage Cocktail 1, BDCA-4 und CD123 verwendet, wodurch sie im Anschluss in eine Subfraktion IFN-alpha-positiver pDCs und IFN-alpha-negativer pDCs separiert werden konnten. In Vorbereitung auf die Durchführung einer RT-PCR und eines DNA-Oligonukleotid-Microarray-Experiments wurde die RNA aus den Zellen isoliert und in cDNA umgeschrieben. Sowohl in der RT-PCR als auch im DNA-Oligonukleotid-Microarray-Experiment zeig-ten sich unterschiedliche Genexpressionen in beiden Subfraktionen. Die Gruppe der IFN-alpha-positiven Zellen zeichnete sich u.a. durch Gene für IFN-alpha, IL12p35, TNSF11, COX-2, Indolamin-2,3-dioxygenase und den IL-10-Rezeptor-alpha aus. Die Gruppe der IFN-alpha-negativen Zellen konnte hingegen Gene für u.a. TNSF13B, Inhibin-betaA, TNSF4, Vitamin-A-Rezeptor-alpha, PGI2 und den TGF-beta-Rezeptor2 vorweisen. Es bleibt ein weite-res Ziel diese Ergebnisse auch auf Protein-Ebene zu verifizieren.Innerhalb dieses Projektes war es möglich, die Gruppe der pDCs in zwei Untergruppen zu separieren eine positiv für IFN-alpha und eine negativ für IFN-alpha. Es zeigte sich eine unterschiedliche Expression von funktionell wichtigen Molekülen innerhalb der beiden Gruppen. OBJECTIVES Human plasmacytoid dendritic cells (pDCs) serve various functions in the immune system such as defense against viral infection and tolerance maintenance. They are enabled to initiate TH1 responses via production of enormous amounts of their main cytokine IFN-alpha. Little is known about their ability to produce further cytokines which could explain their contrary functions in the immune system. This project at-tempts to identify pDC-Subsets based on the analysis of their gene expression.RESEARCH DESIGN AND METHODS Remnants of buffy coats from young and healthy donors were processed in order to gain PBMCs. For stimulation a mixture of CpG-ODN 2216 (5 µg/ml), IL-3 (20 ng/ml) and Dotap (1 µg/µl) was added and cells were incubated for five hours under appropriate conditions. Subsequently, pDCs were labelled with an IFN-alpha Catch Reagent Antibody. After passing through an IFN-alpha Catch Assay, cells were tagged with antibodies (BDCA-4, CD123, IFN-alpha, Lineage Cocktail 1) specific to localize pDCs. Ongoing, pDCs were separated in two different cell popula-tions one positive for production of IFN-alpha and one negative for synthesis of IFN-alpha. For further investigation in terms of RT-PCR and DNA-Microarray, RNA were isolated from cells and converted into cDNA. RESULTS On the basis of sorting the pDCs it was possible to separate the cells in two distinct subsets positive and negative for IFN-alpha. By means of these subsets, it was possible to gain information about their genetic equipping for preparation of cell surface markers and cytokines on basis of mRNA and DNA passing through RT-PCR and DNA-Microarray. It could be verified that the group of IFN-alpha-positive cells expressed genes for e.g. IFN-alpha, IL12p35, TNSF11, COX-2, Indoleamine-2,3-dioxygenase as well as IL-10-Receptror-alpha. The group of IFN-alpha-negative cells was highlighted by genes for e.g. TNSF13B, Inhibin-betaA, TNSF4, Retinoic-Acid-Receptor-alpha, TGF-beta-Receptor2 and PGI2.CONCLUSION The outcome of this project allows dividing pDCs in two different subsets positive or negative for IFN-alpha. Analysis of both groups revealed the expres-sion of functionally important molecules in each separate subset.