Immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Expression der Connexine 26, 32 und 43 im Plazentom des Rindes

Abstract

Direkte Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junction-Kanälen ist ein wichtiger Faktor für die Plazentaentwicklung und für den feto-maternalen Austausch. Wir haben die Rolle der Cx 26, 32 und 43 im bovinen Plazentom während verschiedener Trächtigkeitsstadien und mit besonderem Interesse an den nicht polarisierten, migrierenden Trophoblast-Riesenzellen (TGC) untersucht. Plazentome von 36 Kühen wurden entsprechend ihrer fetalen Scheitel-Steiß-Länge in fünf Trächtigkeitsstadien eingeteilt. Die Proben wurden entweder in gepuffertem Formalin oder Bouin´scher Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet oder sie wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Ein Proteinnachweis erfolgte für Cx 26, 32 und 43 mittels indirekter Immunhistochemie und für das Cx 43 zusätzlich mittels Western-Blot-Verfahren. Die mRNA von Cx 26, 32 und 43 wurde mittels RT-PCR nachgewiesen sowie für Cx 26 und 32 über in situ Hybridisierung in Gewebeschnitten lokalisiert. Cx 26 Protein konnte entlang der feto-maternalen Grenze dargestellt werden. In der in situ Hybridisierung ist eine deutliche Reaktion im maternalen Epithel zu erkennen. In den TGC wird sowohl Cx 26 mRNA als auch das Cx 26 Protein nachgewiesen. Cx 32 mRNA und Protein werden im maternalen Epithel beobachtet. Allerdings beschränkt sich die Proteinexpression ausschließlich auf das maternale Epithel der Septenspitzen, während die mRNA im gesamten maternalen Epithel zu finden ist. Cx 43 Protein konnte sowohl im maternalen Bindegewebe der Krypten und im fetalen Mesenchym als auch in den TGC immunhistochemisch lokalisiert und über das Western-Blot-Verfahren mit einer deutliche Bande bei 43 kDa bestätigt werden. Das Vorhandensein von Cx 43 mRNA im Rinderplazentom wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Direkte Zell-Zell-Kommunikation im Rinderplazentom via Gap Junction-Kanälen scheint neben dem Austausch von Molekülen auch Wachstum und Invasionsvorgänge im Plazentom zu regulieren. Das Vorhandensein von Cx 26 entlang der feto-maternalen Grenzlinie spricht für einen diaplazentären Austausch von Molekülen, insbesondere Glukose, die im Dienst der Nutrition des Fetus steht. Dem Gap Junction-Netzwerk aus Cx 32 und Cx 43 könnte bei der Kontrolle von Wachstum und Invasionsvorgängen eine bedeutende Rolle zukommen. Die Anwesenheit von Cx 32 in der Region, in der die Interdigitation von fetalen Kotyledonen und maternalen Karunkeln beginnt, könnte die Wachstumsrichtung und die Proliferation in dieser Zone steuern. Das Vorkommen von Cx 43 im fetalen Mesenchym und im maternalen Stroma könnte für die Ausbildung einer korrekten architektonischen Struktur des Plazentoms verantwortlich sein. Die Migration, Invasion und Fusion der TGC könnte durch das gleichzeitige Vorhandensein von Cx 26 und Cx 43 reguliert werden. Cell-cell communication via gap junctions has been proved to be an important factor for placental development and feto-maternal exchange. We investigated the role of Connexin 26, 32 and 43 in the bovine placentome, with special attention to the non-polarized migrating trophoblast giant cells. Placentomes from 36 cows were allocated to five groups according to fetal crown-rump-length. Samples were fixed in either buffered formalin or Bouins`solution and embedded in paraffin or were shockfrozen in liquid nitrogen. Connexin 26, 32 and 43 protein was visualized by immunohistochemistry and Cx 43 protein was additionally detected by Western-Blot. The presence of Connexin 26, 32 and 43 mRNA was investigated by RT-PCR and additionally Connexin 26 and 32 mRNA was localized in tissue sections by in situ hybridisation. Cx 26 protein was detected apically on mononuclear trophoblast cells and as cytoplasmic staining in TGC. Cx 26 mRNA is located in maternal epithelium and in TGC. Cx 32 protein expression was observed in the maternal epithelium exclusively on the tips of maternal septa whereas Cx 32 mRNA was detected in the maternal epithelium of the complete placentome. Cx 43 protein was present in maternal, septal stroma and to lesser extent in chorionic villous mesenchyme as well as on TGC. Western blotting and RT-PCR confirmed the presence of Cx 43 protein and mRNA in the bovine placentome. Direct cell-cell communication via specifically localized gap junctional connexins in the bovine placentome is very likely and not only seems to maintain diaplacental exchange of molecules but may also regulate invasion and growth. The existence of Cx 26 at the feto-maternal contact interface indicates exchange of molecules especially glucose with the aim of fetal nutrition. The gap junction network of Cx 32 and 43 might play an essential role in the control of growth and invasion. The presence of Cx 32 in the area where fetal cotyledones and maternal caruncles begin to interdigitate each other might control the direction of growth and proliferation in this zone. Cx 43 in fetal and maternal stroma might support the formation of a correct placentomal architecture. Cx 26 and 43 expression in TGC might regulate migration, depth of invasion and fusion with maternal epithelial cells.