Fusionsproteine aus beta2-adrenergem Rezeptor und GFP als pH-sensible Sensoren
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Zusammenfassung
Eukaryoten können über Rezeptormoleküle der Plasmamembran externe Reize in intrazelluläre Signale umwandeln. Bei G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) wird die Signalübermittlung durch Vorgänge wie Desensibilisierung, Internalisierung und Resensibilisierung gesteuert. So auch beim beta2-adrenergen Rezeptor (beta2AR), welcher der am besten untersuchte GPCR ist. Er gelangt im Vorgang der Internalisierung auf seinem intrazellulären Weg in zytosolische Kompartimente, wie Endosomen und Lysosomen. Der in diesen Organellen vorliegende saure pH soll einerseits durch Konformationsänderungen die Dephosphorylierung und Resensibilisierung der Rezeptoren ermöglichen und dient andererseits in Lysosomen als Voraussetzung für die Aktivität der lysosomalen Hydrolase, welche Rezeptorstrukturen abbaut. Durch diese komplexen Vorgänge wird die Anzahl der Rezeptormoleküle an der Zelloberfläche reguliert und verhindert, dass durch länger andauernde Rezeptorstimulierung eine Daueraktivierung der intrazellulären Signalkaskaden erfolgt. Mit der Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde ein relativ indifferenter, genetisch kodierter zellulärer Fluoreszenzmarker zur Klärung von zellbiologischen Fragestellungen gefunden. Durch Strukturanalysen wurden Mutationsstellen identifiziert, welche die Konstruktion unterschiedlich pH-sensitiver und unterschiedlich farbiger GFP-Mutanten ermöglichten. Durch Konstruktion von Fusionsproteinen aus dem beta2AR und GFP sollten in dieser Arbeit pH-Sensoren erstellt werden, die pH-Veränderungen in der Umgebung des ß2AR während des Vorgangs der Internalisierung nachweisen. Dazu wurde ein pH-sensitives GFP an den N-Terminus des Rezeptors und ein pH-insensitives Fluorophor an den C-Terminus des beta2AR kloniert. Dadurch, dass der C-Terminus des Rezeptors beim Vorgang der Internalisierung im Zytosol verbleibt und der N-Terminus in die unterschiedlichen intrazellulären, kompartimentären Milieus eindringt, sollte durch Messung der Fluoreszenzverhältnisse von pH-sensitivem zu pH-insensitivem Fluorophor eine Aussage über den pH-Wert in der Umgebung des extrazytoplasmatischen Fluorophors möglich sein. Durch genaue Charakterisierung der Rezeptormutanten konnte gezeigt werden, dass die beta2AR-Funktion in den Fusionsproteinen unbeeinflusst blieb und diese auf physiologische Weise internalisierten. Die Rezeptormutanten zeigten außerdem die gewünschten pH-sensitiven Eigenschaften und konnten nachweisen, dass der beta2AR im Vorgang der Internalisierung eine Veränderung seines Umgebungs-pH erfährt.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2006