Microenvironmental Th9 and Th17 lymphocytes induce epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cells thereby promoting metastatic spreading

Abstract

Immune cells in the tumor microenvironment have a critical role in lung cancer control versus progression and metastasis. In this study, we explored the role of tumor-infiltrating-lymphocyte subpopulations in lung cancer progression by performing in vitro co-culturing, in vivo mouse tumor models, and human lung cancer tissue staining. CM from the Co-culture of activated lymphocytes and lung cancer cells was able to induce an EMT transition in both human and mouse tumor cells, characterized by deregulation of epithelial and mesenchymal markers and increased migration. Co-Culture CM displayed a distinct secretome profile when compared to the supernatant of either lymphocytes or cancer cells alone. Specifically, cytokines IL-9, IL-17 A, and F were increased in Co-Culture CM.Detection of Th9 and Th17 cells in tissue microarrays from human lung cancer tissue correlated with a decrease in patient survival and these cells were frequently identified in the stromal area of tumors. Co-Culture of lung cancer cells with the specific Th9 and Th17 subtypes replicated the deregulation of EMT markers and migration induction observed with Lymphocyte CM, thereby pointing toward these cells as responsible for the observed effects on cancer cell behavior. Additionally, Co-culturing of lung cancer cells with Th9 or Th17 cells modulated the expression profile of genes implicated in EMT, metastasis, and angiogenesis, such as MMPs and the Klf family of transcription factors. Stimulation with the individual effector cytokines, IL-9 and IL-17, reproduced the results observed by exposure to CM, further supporting the involvement of Th9 and Th17 cells, and their effector cytokines, in tumor development and progression.Co-injection of Th9 and/or Th17 cells with tumor cells in mouse lung cancer models promoted primary tumor growth and metastasis. Th9 especially affected tumor size and weight after subcutaneous injection, whereas Th17 cells had a specific effect on metastasis in models of primary tumor and metastasis. Consequently, inhibition of IL-9 or IL-17 cytokines by neutralizing antibodies decreased protein expression of EMT markers and slowed lung cancer progression and metastasis. In conclusion, our results assign Th9 and Th17 lymphocytes a prominent role in the induction of lung cancer cell EMT, thereby promoting migration and metastatic spreading and could provide novel therapeutic strategies targeting some of the targets described in our work. Immunzellen im Tumormikromilieu von Lungenkrebs spielen eine wichtige Rolle bei Kontrolle gegenüber dem Fortschreiten des Erkrankungsverlaufs und der Metastasierung. Ziel dieser Studie ist es, die Bedeutung tumorinfiltrierender Subpopulationen von Lymphozyten in der Progression von Lungenkrebs mittels in vitro Kokulturen, in vivo Maus-Tumormodellen und humanem Lungenkrebsgewebe zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass konditionelles Medium (CM) von aktivierten Lymphozyten ko-kultiviert mit Lungenkrebszellen epithelial-mesenchymale Transition (EMT), die durch Deregulierung von Epithel- und Mesenchym-Markern sowie erhöhter Migration charakterisiert ist, in humanen und murinen Tumorzellen auslöst. Im Vergleich zu überständen von Lymphozyten oder Krebszellen allein, zeigte das Ko-Kultur-CM ein eindeutig verändertes Sekretom, wobei besonders stark erhöhte Mengen der Zytokine IL-9, IL-17A und F detektiert werden konnten. Detektion von Th9- und Th17-Zellen durch Microarrays von humanem Lungenkrebsgewebe korrelierte mit erniedrigter Überlebenszeit der Patienten. Zudem konnten diese Zellen häufig im Tumorstroma identifiziert werden. Die durch Lymphozyten-CM ausgelöste Deregulierung der EMT Marker und der Zellmigration konnte durch Ko-Kultur von Lungenkrebszellen mit den Th9- und Th17-Subtypen nachgeahmt werden. Dies deutet darauf hin, dass sie für die Änderung im Verhalten der Tumorzellen verantwortlich sind. Zusätzlich konnte ein verändertes Expressionsprofil von Genen wie MMPs und der Klf-Transkriptionsfaktorfamilie, die mit EMT, Metastasierung und Angiogenese assoziiert sind, in den mit Th9- und Th17-Zellen ko-kultivierten Lungenkrebszellen gezeigt werden. Stimulation mit den Effektorzytokinen IL-9 und IL-17 reproduzierten die durch CM-Behandlung beobachteten Ergebnisse, wodurch weiter unterstützt wird, dass Th9- und Th17-Zellen sowie ihre Effektorzytokine, in der Tumorentwicklung und im Tumorwachstum involviert sind. Ko-injektion von Th9- und/oder Th17-Zellen mit Tumorzellen im Maus-Lungenkrebsmodell verstärkte primäres Tumorwachstum und Metastasierung. Besonders Th9-Zellen zeigten einen Effekt auf Tumorgröße und -gewicht nach subkutaner Injektion, wobei Th17-Zellen spezifisch auf Metastasierung im Primärtumor- und Metastase-Mausmodell wirkten. Inhibition von IL-9 oder IL-17 durch neutralisierende Antikörper verringerten Proteinexpression von EMT Markern und verlangsamten Lungenkrebswachstum und Metastasierung. Abschließend kann aus unseren Ergebnissen geschlussfolgert werden, dass Th9- und Th17-Lymphozyten in der Einleitung von EMT bei Lungenkrebs eine bedeutende Rolle spielen, wodurch Zellmigration und Metastasierung erhöht wird. Die in dieser Arbeit beschriebenen Zielmoleküle können daher als Grundlage zur Entwicklung neuartiger Therapien dienen.