Ziel der Arbeit war es, die <
i>
in-vivo<
/i>
Holophytochromsynthese in <
i>
E.coli<
/i>
zu etablieren, um ausreichend <
i>
in-vivo<
/i>
assembliertes Holophytochrom herstellen zu können. Ferner kann die Methode für Untersuchungen im Rahmen eines <
i>
random-mutagenesis screening<
/i>
Verfahrens nutzbar gemacht werden. Die Etablierung dieser Methode ist für einen entsprechenden Ansatz in <
i>
S.cerevisiae<
/i>
von Vorteil, da dadurch die Möglichkeit entsteht, nach Phytochrom Interaktionspartnern mittels der Hefe-2-Hybrid Methode unter Berücksichtigung des Pr/Pfr-Zustandes von Phytochrom zu suchen.
Um Holophytochrom zu bilden, wurden die entsprechenden Gene aus <
i>
Synechocystis<
/i>
PCC 6803 (<
i>
cph1, ho und pcyA<
/i>
) zur Expression gebracht. Daraufhin konnte erstmals lösliches Holo-Cph1 gebildet werden. Bei näheren Analysen fiel eine hypsochrome (Blau-) Verschiebung von ~5-nm auf, die nur bei einer <
i>
in-vivo<
/i>
, jedoch nicht bei einer <
i>
in-vitro<
/i>
-Assemblierung auftrat.
Durch SDS-PAGE Analysen wurde die Präsenz eines Fusionsproteins aus HO und PcyA festgestellt, welches aufgrund der <
i>
sup<
/i>
-Eigenschaft von <
i>
E.coli<
/i>
(XL1-blue) zustandegekommen war. Durch die Wahl eines entsprechenden <
i>
sup<
sup>
-<
/sup>
E.coli<
/i>
-Stammes konnte die Bildung eines Fusionsproteins verhindert werden. Das Fusionsprotein ergab zwar ein farbliches Pigment, jedoch konnte dieses Pigment kaum mit dem dargebotenen Apo-Cph1 assemblieren.
Durch die <
i>
in-vivo<
/i>
-Assemblierung von Apo-Cph1 mit Phycocyanobilin konnte jedoch nicht die schon für das Apoprotein und für <
i>
in-vitro<
/i>
assembliertes Holo-Cph1 beobachteten Aggregationstendenzen nach Aufschluss der Bakterien verhindert werden. Um diese Aggregationen zu unterbinden, wurde die Co-Expression von molekularen Chaperonen (sHSP und GroE-L/S) untersucht. Die Expression der oben erwähnten molekularen Chaperonen konnte die Löslichkeit von Holo-Cph1 <
i>
in vivo<
/i>
nicht verbessern und die Aggregationsbildung <
i>
in-vitro<
/i>
nicht unterbinden.
Durch Deletion des C-Terminus (Histidin-Kinase-Domäne) von Cph1 entsteht ein Konstrukt (Cph1delta2), das <
i>
in-vitro<
/i>
nicht mehr aggregiert. Cph1delta2 ergab nach Co-Expression mit HO und PcyA ebenfalls vollständig <
i>
in-vivo<
/i>
assembliertes Holophytochrom und konnte nach einer optimierten Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu einem hohen Grad aufgereinigt werden, was sich an dem im UV-Vis gemessenen Absorptionsverhältnis von 1.16 wiederspiegelt.
Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
